奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌β-溶血素基因的克隆、表达与溶血活性分析

论文摘要

根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌RF122β-溶血素（hlb）基因序列,用OLIGO6.0设计一对PCR引物,对金黄色葡萄球菌山东分离株zfb的hlb基因进行PCR扩增、序列测定及生物信息学分析。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌RF122β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示我们克隆的金黄色葡萄球菌山东分离株zfb的β-溶血素氨基酸序列中含有核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶（Endonuclease/Exonuclease/phosphatase family）和金属依赖性水解酶ELSH（Metal-dependent hydrolase）两个保守结构域,说明我们克隆的金黄色葡萄球菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶;进化树分析可见牛源金黄色葡萄球菌山东分离株zfb的β-溶血素与其它β-溶血素/磷脂酶既有高度的同源性,又存在一定的差异。通过对pMD18-T/hlb及pET32a+进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切、连接,将hlb基因定向插入pET32a+,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定表明,成功构建重组表达质粒pET32a+/hlb,并转化入表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,表达产物以融合表达的包涵体形式存在,SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57KD,表达量占菌体总蛋白的23.9%。表达产物利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,并用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,结果显示金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU/mg,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU/mg;以血琼脂平板法检测重组蛋白与无乳链球菌的CAMP反应,结果显示重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。上述结果表明,我们成功克隆并表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,纯化后的重组蛋白保存了很好的溶血活性,而且该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素具有明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性,为进一步研究金黄色葡萄球菌β-溶血素的致病与免疫机理、疫苗设计提供条件。此外,重组蛋白具有和无乳链球菌发生CAMP反应的性质,可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.前言
• 1.1 乳房炎的危害
• 1.2 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌概述
• 2 金葡菌β-溶血素研究进展
• 2.1 金葡菌β-溶血素的制备
• 2.2 金葡菌β-溶血素的纯化
• 2.3 金葡菌β-溶血素的性质
• 2.4 影响金葡菌β-溶血素活性的各种因素
• 2.5 金葡菌β-溶血素的溶原转换问题的研究进展
• 2.6 利用CAMP现象检测无乳链球菌
• 3 本实验的研究目的和研究意义
• 第二章 试验内容
• 实验一、金葡菌山东分离株（zfb）β-溶血素基因的克隆与生物信息学分析
• 1 试验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要药品及试剂
• 1.3 主要溶液的配制
• 1.4 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 金葡菌β-溶血素基因的T-载体克隆及鉴定
• 2.2 金葡菌β-溶血素基因的序列测定及生物信息学分析
• 3 结果及分析
• 3.1 PCR产物分析
• 3.2 重组克隆质粒的构建与鉴定
• 3.3 序列分析
• 3.4 金葡菌β-溶血素生物信息学分析
• 4 讨论
• 实验二、金葡菌山东分离株（zfb）β-溶血素的表达与溶血活性分析
• 1 试验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要药品及试剂
• 1.3 主要溶液的配制
• 1.4 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 金葡菌β-溶血素基因重组表达菌株的构建及转化
• 2.2 重组表达质粒的小量诱导表达
• 2.3 重组蛋白的纯化
• 2.4 重组蛋白溶血活性研究
• 3 结果及分析
• 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定
• 3.2 SDS-PAGE分析
• 3.3 表达产物的生物活性分析
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文目录