论文题目: 仔猪胰腺干细胞的分离鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 临床兽医学
作者: 张慧茹
导师: 窦忠英
关键词: 胰腺干细胞,仔猪,分离,鉴定,胰岛素,细胞,多项分化
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 近年来糖尿病的患病率日益增高,已成为继心血管疾病、肿瘤之后第三大高发慢性病。快速、有效、长期地补充机体胰岛素分泌不足是糖尿病治疗的根本方案。目前采用三种方法补充机体胰岛素分泌不足:传统皮下注射外源性胰岛素,虽然有效但很难阻止并发症的发生和发展,注射剂量经常与机体需要不相符,且每日每餐均需注射很繁琐;胰腺和胰岛器官移植,可解决胰岛素供需不符的问题,但移植器官难得、手术复杂、不良反应多;移植分泌胰岛素的干细胞,可以弥补上述两种方法不足,简易地注入人体成为自身胰腺细胞,一次给药长期有效,机体还可根据需要,调节产生胰岛素和其他辅助细胞因子等的多种细胞比例,避免并发症发生,干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应低。但也是由于供体组织严重匮乏限制其应用发展,人们转向寻找异种动物胰腺组织作为供体组织来源时发现,猪繁殖性能强,组织来源充足,胰岛素结构和生物活性类似于人胰岛素,血糖调定点同人接近,猪胰腺细胞可在人血清中生存对人体无害,因此,仔猪胰腺干细胞可作为最佳的异种动物胰腺干细胞的供体细胞,对仔猪胰腺干细胞的研究是糖尿病治疗的新希望。本试验从仔猪胰腺干细胞分离培养、生物学性能测定及诱导分化多能性三个方面进行研究,为仔猪胰腺干细胞的临床应用提供基础资料。1. 建立仔猪胰腺干细胞的分离方法和培养体系。取新鲜的仔猪胰腺组织,冰上操作,0.25%胰酶消化,形成小细胞团和单个细胞,过滤,低速、多次离心,或以5%BSA作离心液离心,均可获得高活力的胰腺细胞,用层粘连蛋白或明胶铺被培养皿,以低糖DMEM 培养液添加10%血清及10 mmol/L 烟碱作为基础培养液,培养2d 后,除去未贴壁细胞,更换为去除烟碱、添加10 ng/mL EGF的基础培养液,长期培养以促进胰腺干细胞体外增殖生长。证实仔猪胰腺内分泌祖细胞呈多突起细胞形态。2. 仔猪胰腺干细胞各项生物学特性。原代细胞以细胞团和单个细胞贴壁,细胞团中不断有细胞脱离、悬浮,保留的贴壁细胞和单个细胞生长,约7d 出现多突起内分泌祖细胞,克隆样生长,很快连接成网状;小圆细胞数量增多;多角形导管上皮干细胞增殖慢。电镜观察多突起细胞具50~80μm长突起、有极性、核质比大、细胞器不发达;小圆细胞为直径10~12μm、有微绒毛、胰岛素阳性;多角形细胞呈圆形、核质比大、可见胞质内细胞器和细小分泌颗粒。成功地分离到三种形态的胰岛干细胞:多角形胰导管细胞、多突起内分泌祖细胞和小圆细胞。免疫组化鉴定,分离的细胞表达胚胎干细胞标志SSEA-1、SSEA-4、Oct4,也表达胰腺干细胞的标志PDX-1、CK7 等,证实分离的细胞具有胰腺干细胞特征。测定仔猪胰腺干细胞的生长曲线。分离培养的胰腺干细胞体外生长12~15d 可传代,
论文目录:
文献综述
第一章 成体干细胞可塑性研究
1.1 成体干细胞的概念
1.2 成体干细胞的生物学特性
1.2.1 成体干细胞静息态
1.2.2 成体干细胞的含量少
1.2.3 成体干细胞的识别筛选
1.2.4 干细胞的体外生长
1.2.5 成体干细胞的壁龛
1.3 干细胞的分化及成体干细胞多能性的机理
1.3.1 细胞内源性调控
1.3.2 细胞外部调控
1.3.3 其他因素
1.4 成体干细胞可塑性的特点
1.4.1 横向分化
1.4.2 分化的逆转
1.4.3 统一干细胞的存在
1.4.4 多能干细胞残余
1.4.5 组织中干细胞的异质性假说
1.5 质疑成体干细胞可塑性
1.5.1 干细胞的可塑性可能与细胞融合有关
1.5.2 造血干细胞“可塑性”证据不足
1.6 建立标准
1.7 结论和前景
第二章 胰腺干细胞的研究进展
2.1 胰腺大体结构的发育
2.2 胰腺(岛)干细胞的概念
2.3 胰腺干细胞分子发育途径
2.3.1 转录表达的第一阶段内胚层预胰区域的发生
2.3.2 转录因子表达的第二阶段--胰腺功能细胞的分化
2.3.3 后期内分泌细胞系决定
2.4 胰腺干细胞的表面标志
2.5 作为胰腺干细胞的几种来源
2.5.1 胚胎干细胞
2.5.2 成体胰腺干细胞的候选细胞
2.5.3 其他成体干细胞转分化
2.5.4 胰腺和其他成体组织源干细胞的起源
2.6 胰腺干细胞的培养
2.6.1 胰腺源导管上皮细胞的分离和培养
2.6.2 胰岛源干细胞分离和培养
2.6.3 胚胎干细胞诱导为胰腺干细胞
2.6.4 其他成体干细胞向胰腺干细胞的诱导分化
2.7 胰腺干细胞的成熟和检测
第三章 猪胰腺干细胞研究进展
3.1 猪胰腺干细胞替代人胰腺干细胞的可行性
3.1.1 猪胰岛素同人胰岛素的异同
3.1.2 材料来源充足
3.1.3 仔猪胰腺干细胞比例高、增殖力强
3.1.4 胰腺细胞的血糖调定点同人接近
3.1.5 猪胰腺细胞能在人血清中存活对人体无害
3.1.6 免疫原性低
3.1.7 无特殊病原菌仔猪的控制
3.2 仔猪胰腺干细胞的生物学特性
3.2.1 取材
3.2.2 细胞分离方法
3.2.3 培养
3.2.4 培养体系
3.2.5 维持培养和传代
3.3 胰腺干细胞的分离培养及传代难点
3.3.1 去除杂质纯净细胞
3.3.2 贴壁
3.3.3 扩增
3.4 猪胰腺干细胞类型的问题
3.5 猪胰腺干细胞的诱导分化
3.6 猪胰腺干细胞的可塑性(横向分化)
3.7 猪胰腺干细胞研究中存在问题及解决办法
实验研究
引言
糖尿病的发病情况
仔猪胰腺干细胞研究的必要性
第四章 仔猪胰腺干细胞分离培养方法的建立
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 方法
4.2 结果
4.2.1 不同消化酶对消化影响
4.2.2 不同离心方式对分离细胞影响
4.2.3 不同细胞外基质和不同培养液成分对细胞贴壁的影响
4.2.4 不同基础培养液对细胞贴壁、种类和生长的影响
4.2.5 促干细胞增殖因子的筛选
4.3 讨论
4.3.1 消化分离方法
4.3.2 细胞生长微环境
4.3.3 分离细胞为仔猪胰岛干细胞
4.3.4 分步培养的培养策略
4.4 小结
第五章 仔猪胰腺干细胞生物学特性
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.2 结果
5.2.1 细胞形态和生长特性
5.2.2 细胞表面标志
5.2.3 细胞的生长曲线
5.2.4 细胞解冻活力检测
5.3 讨论
5.3.1 分离的细胞具有干细胞形态
5.3.2 细胞的表面标志变化
5.3.3 细胞增殖和悬浮
5.3.4 冷冻与解冻效果分析
5.4 小结
第六章 仔猪胰腺干细胞诱导分化
6.1 材料和方法
6.1.1 材料
6.1.2 方法
6.2 结果
6.2.1 向?细胞诱导
6.2.2 向心肌细胞诱导
6.2.3 向神经细胞诱导
6.2.4 向成骨细胞诱导
6.3 讨论
6.3.1 向β细胞诱导
6.3.2 向心肌细胞诱导
6.3.3 向神经细胞诱导
6.3.4 向成骨细胞诱导分化
6.4 小结
结论
下一步工作设想
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-12-22
参考文献
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