枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌融合子的构建及其生物学特性研究

论文摘要

本研究将具有淀粉酶和植酸酶酶活等优良特性的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtills）和具有纤维素降解能力的的生孢噬纤维菌（Sporocytophaga myxocoecoides）进行原生质体融合，希望得到具有双亲优良特性于一体的益生菌。通过筛选最终得到一株具有淀粉酶、植酸酶酶活及强烈降解纤维素多功能融合子。本研究包括以下部分： 1．分离纯化枯草芽孢杆菌，并对其进行生理生化和酶活鉴定。结果获得具植酸酶和淀粉酶酶活的枯草芽孢杆菌BS-1菌株。 2．分别对枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌进行生长曲线测定，结果显示枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌对数生长中期分别为6小时和6.5小时。 3．利用单因素试验探讨影响枯草芽孢杆菌和生孢噬纤维菌原生质体形成率和再生率的因素，结果显示：BS-1和SM-1最佳溶菌酶浓度为5mg／ml，6mg／ml；酶解时间为1小时。在这种条件下，BS-1菌株的原生质体形成率和再生率分别为90.28％，10.80％；SP-1菌株的为78.66％和9.70％ 4．利用热灭活的方法对生孢噬纤维菌原生质体进行灭活处理，结果显示：灭活时间50分钟，灭活温度为60℃。 5．在PEG6000和Ca2+存在下使二者在37℃水浴箱中融合60min。并进行可稳定遗传融合子的筛选合子。在选择培养基上获得87株融合子，连续传代10代，获得一株稳定的融合子。 6．比较亲本及融合子菌落表型，显微形态，生化特性，酶活鉴定，对融合子进行初步鉴定。 7．用DNA琼脂糖电泳方法进一步对融合子进行DNA鉴定，确证初筛结果。 8．对融合子及其亲本的纤维素酶，植酸酶和淀粉酶活性进行测定。结果证明融合子淀粉酶酶活高于其亲本，纤维素酶活和生孢噬纤维菌相当，植酸酶活性略低于枯草芽孢杆菌。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.研究目的和意义
• 2.生孢噬纤维菌的研究概况及纤维素酶在水产上的开发利用
• 3.枯草芽孢杆菌的研究概况及其植酸酶在水产上的开发利用
• 4.原生质体融合技术的研究概况
• 第二章 枯草芽孢杆菌BS-1菌株的分离纯化
• 1.实验材料
• 2.方法
• 2.1 菌株的分离纯化
• 2.2 菌株鉴定
• 3.结果与分析
• 4.讨论
• 第三章 融合子的构建方法与条件
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 菌种培养
• 2.2 两亲本菌株生长曲线的测定
• 2.3 原生质体的制备
• 2.4 生孢噬纤维菌SM-1菌株原生质体灭活
• 2.5 原生质体的融合及再生
• 2.6 融合子的检出
• 2.7 原生质体形成率、再生率和融合率的计算
• 3.结果与分析
• 3.1 对数生长期的选择
• 3.2 溶菌酶浓度和酶解时间与原生质体形成的关系
• 3.3 处理时间和温度对原生质体灭活效果的影响
• 3.4 原生质体融合及融合子的检出
• 4.讨论
• 第四章 融合子的生物学特性及其DNA同源性研究
• 1.实验材料
• 2.方法
• 2.1 融合子菌株形态结构鉴定
• 2.2 细菌生理生化特性鉴定
• 2.3 细菌DNA同源性鉴定
• 2.3.1 DNA的提取
• 2.3.2 DNA的纯度鉴定
• 2.3.3 DNA琼脂糖电泳
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第五章 融合子纤维素酶、植酸酶和淀粉酶酶活的测定及其与亲本菌株的比较
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1 纤维素酶的检测和酶活测定
• 2.1.1 刚果红纤维素平板识别
• 2.1.2 滤纸崩解测试
• 2.1.3 纤维素酶活力测定
• 2.2 植酸酶的检测和活性测定
• 2.2.1 植酸酶的定性检测
• 2.2.2 植酸酶的活性测定
• 2.3 淀粉酶定性测定和酶活比较
• 3.结果与分析
• 3.1 标准曲线的绘制
• 3.2 纤维素酶、植酸酶、淀粉酶的鉴定和酶活测定
• 4.讨论
• 结论和后续研究
• 参考文献
• 致谢
• 英文缩写符号说明
• 作者简介
• 主要经历
• 论文发表