狂犬病病毒CVS株G、N基因的克隆及表达

论文摘要

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus,RV）感染引起的一种致死性人畜共患传染病。该病呈全球性分布,亚洲尤其是我国流行较为严重,对人类生命安全构成严重威胁。目前注射疫苗仍是控制狂犬病的最可靠的手段之一,但现今使用的常规疫苗因存在着难于避免的安全隐患等问题,故研究和开发免疫效果好、成本低廉的新型疫苗已成为研究热点。本研究通过RT-PCR方法分别获得了CVS株糖蛋白（glycoprotein,GP）基因和核蛋白（Nucleoprotein,NP）基因的编码区序列,测序表明GP基因序列长1 575bp,编码524个氨基酸残基:NP基因序列长1 353bp,编码450个氨基酸残基。与国内外典型代表毒株CVS-11、PV-11、SRV 9、SAD-B19、HEP-Flury、ERA、3aG等进行序列比较,GP、NP核苷酸同源性分别为89.0%～98.8%、92.6%～99.6%,氨基酸同源性分别为87.2%～97.0%、97.6%～99.3%。将NP基因克隆到原核表达载体pET28a（+）中,构建了重组质粒pET-N,将其转化表达菌BL21（DE3）,于37℃1.0mmol/L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为54 kDa处出现一条新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。质谱鉴定的结果表明成功表达了狂犬病毒N蛋白,用该蛋白免疫家兔,获得兔源抗NP抗体,为RV诊断方法的建立奠定了基础。将GP基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-G。pVL-G与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,经多轮次空斑筛选,获得携带有GP基因的重组病毒rBmNPV（G）。将重组病毒注射蚕蛹,经双抗体夹心ELISA法检测,抗原效价可达1:4096,表明GP在蚕蛹中获得了高效表达,其表达量可达灭活抗原的10倍以上,为狂犬病基因工程疫苗的研究奠定了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 文献综述
• 第一章 狂犬病毒的分子生物学研究进展
• 1.1 狂犬病毒的形态结构
• 1.2 狂犬病毒的基因组结构
• 1.3 狂犬病毒的基因分型
• 1.4 狂犬病毒的各种蛋白质结构及其功能
• 1.4.1 糖蛋白的结构及与功能的关系
• 1.4.2 核蛋白的结构及与功能的关系
• 1.4.3 基质蛋白的结构及与功能的关系
• 1.4.4 磷蛋白的结构及与功能的关系
• 1.4.5 转录大蛋白的结构及与功能的关系
• 第二章 家蚕杆状病毒表达系统的研究进展
• 2.1 家蚕杆状病毒表达系统的优点
• 2.2 家蚕杆状病毒表达系统的研究
• 2.2.1 一般方法
• 2.2.2 转移载体的发展
• 2.2.3 线性化杆状病毒基因组
• 2.2.4 外源蛋白表达的影响因素
• 2.3 家蚕杆状病毒表达系统在疫苗生产方面的研究及应用
• 参考文献
• 研究报告
• 第一章 狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的克隆及在原核表达系统中的表达
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 材料
• 1.2.1.1 狂犬病病毒株、细菌菌株及质粒载体
• 1.2.1.2 工具酶及其它试剂盒
• 1.2.1.3 仪器与设备
• 1.2.2 方法
• 1.2.2.1 N基因的克隆
• 1.2.2.2 重组原核表达载体的构建
• 1.2.2.3 表达载体在大肠杆菌中的表达及鉴定
• 1.2.2.4 包涵体的分离与纯化
• 1.2.2.5 重组蛋白的质谱鉴定
• 1.2.2.6 兔源抗RV NP抗体的制备
• 1.3 结果
• 1.3.1 病毒的传代
• 1.3.2 N基因的扩增和克隆
• 1.3.3 序列测定与分析
• 1.3.4 重组表达质粒的鉴定
• 1.3.5 SDS-PAGE电泳及目的蛋白的分离、纯化结果
• 1.4 讨论
• 第二章 狂犬病毒CVS株糖蛋白基因的克隆及在重组家蚕杆状病毒中的表达
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 狂犬病病毒株、细菌菌株及质粒载体
• 2.2.1.2 工具酶及其它试剂盒
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 G基因的克隆
• 2.2.2.2 重组杆状病毒载体的构建
• 2.3 结果
• 2.3.1 G基因克隆
• 2.3.1.1 G基因的PCR电泳结果
• 2.3.1.2 重组质粒的鉴定结果
• 2.3.1.3 重组质粒的序列分析
• 2.3.2 重组杆状病毒转移载体的构建
• 2.3.3 G基因在蚕体中的表达结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介
• 附录