论文摘要
本论文主要内容包括在甘蓝型油菜中克隆得到异胡豆苷合成酶（Strictosidine synthase，下称STR）基因全编码区序列，以及利用单引物PCR扩增方法克隆得到STR 5’端启动子序列，并对这两个序列进行了分析。提取了甘蓝型油菜幼嫩花蕾（长度小于0.2 mm）总RNA，通过RACE-PCR获得了甘蓝型油菜BnSTR全长cDNA序列，并通过Northern blot和半定量RT-PCR对甘蓝型油菜BnSTR进行了表达分析。提取甘蓝型油菜总DNA，设计10个只含有10个碱基的单引物，经过三轮单引物PCR扩增，将扩增得到的条带割胶回收，验证得到STR 5’端启动子序列，并利用相关的软件对这段序列进行了生物信息学的分析。在无花瓣与正常甘蓝型油菜幼嫩花蕾（长度小于0.2 mm）建立的差异表达文库中发现了STR基因的一个cDNA片段（约300bp，以下称G21），根据这个片段设计引物，以正常甘蓝型油菜的RNA反转录而成的cDNA为模板，结合5’和3’cDNA末端快速扩增PCR（RACE-PCR）方法，扩增得到了G21上游约900bp的片段和下游约300bp的片段各一条。将这两条扩增带分别纯化回收，与pMD18-T载体连接，转化得到了这两个cDNA片段的克隆。序列测定后与G21拼接，经PCR扩增得到了异胡豆苷合成酶基因（STR）的cDNA全序列（BnSTR）。BnSTR cDNA全长1408 bp，开放阅读框从第20个碱基（ATG）开始到第1291个碱基（TAG）结束，共编码423个氨基酸。通过blast进行同源性分析结果显示，甘蓝型油菜中异胡豆苷合成酶与拟南芥中一个异胡豆苷合成酶基因的同源性达到88％。BnSTR推导蛋白质序列与植物、动物及细菌中STR-like比对结果显示，除了与拟南芥中STR具有高度相似性以外，与其他植物、动物、细菌的STR-like家族成员相似性很低，但大部分的蛋白位点都位于相对的保守区域内。半定量RT-PCR和Northern杂交结果显示，与野生型相比，BnSTR在无花瓣突变型幼嫩花蕾中表达量明显下降，表明BnSTR的功能可能与花瓣的发育有关。启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件，为了了解STR基因的转录调控机制，以甘蓝型油菜基因组DNA作为模板，从设计的一组10碱基引物中选取Primer8，Primer7和Primer3进行三轮单引物PCR扩增，在第三轮扩增产物中克隆到长为986 bp的目的片段。同源性比对的结果表明，该片段3’端295bp为BnSTR基因的部分编码区，而5’端691 bp则为该基因的侧翼序列（简称为BnSTR-pro，GeneBank登录号为EF566876）。BnSTR基因的5’侧翼区共含有2个TATA盒、2个CAAT盒、2个ARR1AT盒、2个CACTFTPPCA1盒、3个DOFCOREZM基序、3个EBOXBNNAPA／MYCCONSENSUSAT基序、1个POLLENILELAT52基序、GAREAT基序、GATA盒、SURECOREATSULTR11基序，ACGTT盒，MYB1AT、GT1CONSENSUS基序、NODCON1GM／OSE1ROOTNODULE、ACGTATERD1、REALPHALGLHCB21、GTGANTG10、ROOTMOTIFTAPOX1、SEF4MOTIFGM7S基序等多种顺式作用元件。这些相同或相似的顺式作用元件与植物受光调控、抗旱、抵御微生物感染、受激素调节以及增强基因的转录活性相关，同时也具有一定的组织特异性。同源性比较分析，油菜BnSTR-pro与拟南芥STR基因的5’侧翼区AtSTR-pro同源性较高，为62.87％