猪细小病毒—博卡病毒—伪狂犬病毒三价基因工程疫苗的研究

论文摘要

疫苗免疫是预防猪病毒性疾病的重要手段,而且随着诊断技术的进步,发现混合感染是猪发病的一种常见形式,因此“一针防多病”是对疫苗研究提出的新要求。已报道利用PRV作为活病毒载体,将外源基因插入到PRV基因组中是多价苗研制的一种重要方法,并且取得了一定的防治效果。PRV和PPV都是导致母猪繁殖障碍性疾病的重要病原,给养猪业造成巨大经济损失。已知PPV对PCV-2导致的PMWS在临床症状表现上具有明显的增强作用,而PBoV’恰好又是在患有PMWS的仔猪中被发现的,同时有报道称PBoV与仔猪呼吸道感染以及仔猪腹泻等症状有关,但关于PBoV在疫苗研制上的研究还是空白。因此,以弱毒株伪狂犬病毒为载体,构建一株可以同时预防PRV、PBoV、PPV的重组病毒,是非常具有研究与应用价值的。而且目前在PBoV的诊断上方法较单一,主要集中在PCR检测,因此本实验还制备PBoV结构蛋白VP2的单克隆抗体,为后续研制PBoV的ELISA诊断试剂盒打下一定基础。1. PBoV结构蛋白VP2单克隆抗体的研制从PBoV阳性病料中成功克隆出VP2基因,并连接到pET-30a载体中,鉴定正确后转化到感受态细胞BL21中诱导表达,发现在48kDa左右处有明显表达条带。纯化后免疫小鼠,对免疫效价予以检测,达到融合要求后与SP2/0融合,经过ELISA, Western-blot等实验筛选,成功获得了4株单克隆抗体。2.三价重组病毒的构建以TK-/gE-/lacZ+作为亲本毒株,以pIECMV作为中间转移载体。分别将PBoV、PPV的VP2基因以及相对的CMV启动子和PloyA终止子插入到转移载体中,在IBRS-2细胞中共转染重组转移载体以及用EcoR I酶切后的亲本株病毒基因组。36h-54h收获病变细胞,通过PCR检测、空斑实验筛选纯化,成功筛选到重组伪狂犬病毒,Western-blot实验证明PPV、PBoV的VP2蛋白都得到了表达,其中PPV的VP2蛋白约为64kDa, PBoV的VP2蛋白约为62kDa。最后通过测定病毒生长曲线以及连续传代培养等实验证明外源基因的插入并没有影响PRV的增殖。3.三价重组病毒的免疫效果评估分别将105.0TCID50的亲本株病毒、重组病毒以及同体积的MEM免疫小鼠,首免后第四周二免,分别采集0、14、28、42、56天的血清进行ELISA抗体水平检测以及PRV中和抗体水平检测。发现实验组可以诱导小鼠产生针对PPV和PBoV的ELISA抗体；在PRV中和抗体结果上,重组病毒组与亲本株病毒组相近。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（ABBREVIATION）
• 第1章 文献综述
• 1.1 猪细小病毒的概述
• 1.1.1 猪细小病毒病的研究进展
• 1.1.2 PPV基因组结构及主要编码蛋白
• 1.1.3 PPV的生物学性质
• 1.1.4 PPV疫苗的研究进展
• 1.2 猪博卡病毒的概述
• 1.2.1 猪博卡病毒的研究进展
• 1.2.2 猪博卡病毒基因组结构及主要编码蛋白
• 1.2.3 猪博卡病毒的诊断与预防
• 1.3 猪伪狂犬病毒的概述
• 1.3.1 猪伪狂犬病的研究进展
• 1.3.2 伪狂犬病毒基因组结构及主要编码蛋白功能研究
• 1.3.3 伪狂犬病毒基因缺失疫苗的研究
• 第2章 研究目的与意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细菌、病毒和细胞
• 3.1.2 载体
• 3.1.3 工具酶及主要试剂
• 3.1.4 主要缓冲液与相关试剂的配制
• 3.1.4.1 细菌与细胞培养基相关试剂
• 3.1.4.2 ELISA实验相关试剂
• 3.1.4.3 SDS-PAGE和Western-blot实验相关试剂
• 3.1.4.4 原核表达蛋白纯化相关试剂
• 3.1.4.5 空斑实验相关试剂
• 3.1.5 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验引物
• 3.2.2 目的片段的扩增
• 3.2.3 目的片段及载体的酶切及连接反应
• 3.2.4 连接产物和质粒的转化
• 3.2.5 质粒的制备与酶切鉴定
• 3.2.6 原核蛋白的表达
• 3.2.7 目的蛋白的纯化
• 3.2.8 细胞转染
• 3.2.9 单克隆抗体制备过程中动物免疫程序
• 3.2.10 细胞融合
• 3.2.11 方阵滴定法确定最佳包被浓度
• 3.2.12 间接酶联免疫吸附试验
• 3.2.13 杂交瘤细胞的克隆及抗体的制备
• 3.2.14 SDS-PAGE电泳实验
• 3.2.15 Western-blot分析
• 3.2.16 病毒基因组的大量提取
• 3.2.17 空斑实验
• 3.2.18 制备检测重组病毒的PCR模板
• 3.2.19 重组病毒的纯度检测
• 3.2.20 病毒生长曲线的测定
• 50的测定'>3.2.21 病毒TCID₅₀的测定
• 3.2.22 重组病毒小鼠免疫
• 3.2.23 ELISA抗体水平检测
• 3.2.24 中和抗体水平检测
• 第4章 结果与分析
• 4.1 单克隆抗体的制备
• 4.1.1 PBoV-VP2原核及真核表达载体的构建
• 4.1.2 PBoV-VP2原核表达和纯化
• 4.1.3 蛋白最佳包被浓度的确定
• 4.1.4 免疫小鼠效价的确定
• 4.1.5 单克隆抗体的Western-blot验证
• 4.2 重组病毒的制备实验
• 4.2.1 中间转移载体的构建
• 4.2.2 重组病毒的筛选与纯化
• 4.2.3 重组病毒LacZ基因的检测
• 4.2.4 重组病毒中蛋白表达的鉴定
• 4.2.5 重组病毒的增殖曲线
• 4.2.6 重组病毒在不同细胞上的增殖滴度
• 4.2.7 重组病毒的遗传稳定性研究
• 4.2.8 病毒免疫小鼠的ELISA抗体水平检测
• 4.2.9 病毒诱导产生的中和抗体水平检测
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 单克隆抗体制备过程中免疫原的制备
• 5.1.2 单克隆抗体的验证
• 5.1.3 亲本毒株的选择
• 5.1.4 转移载体与亲本株病毒基因组
• 5.1.5 重组病毒的生物学特性研究
• 5.1.6 重组病毒诱导动物的免疫反应
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢