论文摘要
第一部分GSPE对糖尿病大鼠主动脉保护作用的研究研究背景随着社会的发展及人们生活水平的提高,糖尿病（diabetes mellitus,DM）的发病率逐年增加,并已成为仅次于心脑血管病和肿瘤之后第三位的常见病。糖尿病不仅以持续性的高血糖为其特点,更重要的是高血糖所带来的血管并发症的损害。自从胰岛素应用于临床以来,糖尿病因急性并发症致死者明显减少,而糖尿病的慢性血管并发症则成为患者早死及致残的首要原因。葡萄子原花青素（grape seed procyanidine extracts,GSPE）是从葡萄子中提取的一种多酚类化合物,属生物黄酮类,具有强大的抗氧化和抗非酶糖基化作用。大量证据表明GSPE对心血管系统具有显著的保护作用,它能够显著抑制糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）诱发血管内皮细胞糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）表达和选择性抑制血管细胞黏附分子的分泌,从而保护血管内皮细胞的糖基化损伤;并且GSPE能抑制糖尿病大鼠体内蛋白非酶糖基化,减少血清AGEs的形成。GSPE是否能够减轻糖尿病主动脉损伤的研究,目前国内外尚未见报道。为了进一步探讨GSPE对糖尿病主动脉损伤的保护作用,本研究采用链脲佐菌素（STZ）所致糖尿病大鼠模型,通过测定反映大动脉功能的经典指标——脉搏波速度（pulsewave velocity,PWV）,同时应用光镜和电镜观察大鼠主动脉平滑肌细胞移行、增殖和血管损伤的程度,以探索GSPE治疗的可能性,为临床治疗糖尿病慢性并发症提供新的途径。研究目的1.研究GSPE对糖尿病大鼠主动脉功能的影响,应用16导生理记录分析系统观察24周后各组大鼠主动脉PWV、中心和外周血压;2.研究GSPE对糖尿病大鼠主动脉形态学的影响,观察24周后各组大鼠主动脉组织的病理学和超微结构变化。研究方法雄性健康Wistar大鼠80只,体重180-220g。实验前动物按空腹体重编号,随机选出15只作为正常对照组（C1组）,15只为GSPE正常治疗组（C2组）,每日予GSPE 250mg/kg灌胃。余50只大鼠尾静脉注射0.1%链脲佐菌素（55mg/kg）建立糖尿病大鼠动物模型,注射后5天用One TouchⅡ血糖仪测定大鼠尾微量血的血糖,尿糖试纸检测定性尿糖。尿糖在+++以上,空腹血糖＞16.7mmol/l为糖尿病模型成功的标准。成模后平衡一周,剔除未成模及血糖恢复的大鼠后剩余40只,将其随机分为2组:20只为糖尿病未治疗组（DM1组）,实验期间血糖稳定在16.7mmol/l以上;20只为糖尿病GSPE治疗组（DM2组）,确定成模血糖稳定1周后,每日予GSPE250mg/kg灌胃。24周后,用16导生理记录分析系统测定各组大鼠PWV、中心和外周血压。然后处死大鼠,采血测FBG、糖化血红蛋白(HbA1C)、AGEs等指标;对各组大鼠胸主动脉进行HE、PAS染色,观察病理变化,测定胸主动脉内径和中膜壁厚,并计算中膜壁厚/胸主动脉内径比值、弹性模量（EM）和璧应力（WS）;应用透射电镜观察胸主动脉组织的超微结构变化,并进行大鼠主动脉组织RAGE免疫组织化学染色,半定量分析主动脉RAGE蛋白的表达。研究结果1.一般观察DM1组大鼠污秽无泽,明显消瘦,多尿、多饮,血糖波动在较高水平（＞20mmol/L）;GSPE治疗组糖尿病大鼠上述表现减轻,精神状况良好,血糖降低,但仍高于C1组大鼠。C1和C2组大鼠生长及营养状况良好。2.GSPE对糖尿病大鼠体重、FBG、HbA1c和AGEs的影响实验前4组大鼠的体重和血糖均无统计学意义（P＞0.05）。实验结束时,DM1组大鼠体重明显低于C1组同期体重（P＜0.01）,而FBG、HbA1c和AGEs则显著高于C1组（P＜0.05）;DM2组大鼠与DM1组相比,GSPE能够显著改善糖尿病大鼠的体重和AGEs,而血糖控制好转但无显著性差异（P＞0.05）。3.GSPE对糖尿病大鼠中心和外周血压、PWV、WS和EM的影响实验结束时,DM1组与C1组相比,PWV显著增快（P＜0.01）,中心收缩压、舒张压、平均动脉压和脉压、外周收缩压、平均动脉压和脉压显著升高（P＜0.01）,胸主动脉内径、中膜壁厚、中膜壁厚/胸主动脉内径比值和EM显著增加（P＜0.05）,而WS显著降低（P＜0.05）。DM2组与DM1组相比,GSPE能够显著减慢PWV,降低中心收缩压、舒张压、平均动脉压和脉压、外周收缩压、平均动脉压和脉压,减小胸主动脉内径、中膜壁厚、中膜壁厚/胸主动脉内径比值和EM（P＜0.05）。4.GSPE对主动脉组织形态学的影响HE和PAS染色:C1组和C2组:主动脉内膜、中膜和外膜分界清楚。光镜下见内膜光滑,内皮细胞形态规则、排列整齐,中膜主要由呈同心排列的弹性纤维膜组成,无增厚,基质内可见有环形的平滑肌细胞、排列规则无明显PAS阳性物质沉积;DM1组:大鼠主动脉壁层次欠清晰,内皮细胞损伤、突起、形态不规则,中膜明显增厚,可见大量增殖的平滑肌细胞,平滑肌细胞和弹性纤维排列紊乱其中PAS阳性物质多见;DM2组:GSPE显著改善糖尿病大鼠主动脉的形态,内膜较完整,内皮细胞损伤减轻,中膜增厚明显减轻,平滑肌细胞和弹性纤维排列较规则其中PAS阳性物质少见。5.GSPE对主动脉超微结构的影响C1组和C2组:内皮细胞凸向血管腔,核染色质分布正常,胞质内可见大量质膜小泡;内皮下形态正常;平滑肌细胞核染色质分布正常,胞质内密斑和密体丰富,可见高尔基复合体、线粒体、内质网等细胞器。DM1组:内皮细胞呈高电子密度,内皮下结构疏松,可见插入的平滑肌细胞,亚结构不清晰,中膜平滑肌细胞细胞器增多,密斑、密体隐约可见。DM2组:内皮下结构基本正常,平滑肌细胞插入少;中膜平滑肌细胞细胞器多,肌细胞的特征明显。6.GSPE对主动脉组织RAGE蛋白表达的影响免疫组织化学染色显示,实验结束时,糖尿病组大鼠主动脉组织内皮细胞上RAGE阳性染色颗粒丰富,而DM2组较DM1组RAGE阳性染色颗粒明显减少。糖尿病组与正常对照组相比,主动脉组织RAGE灰度值显著减少和阳性细胞数增加（P＜0.01）,表明蛋白表达增加;GSPE治疗后DM2和DM1组相比主动脉RAGE灰度值增加和阳性细胞数减少（P＜0.01）,表明RAGE蛋白表达减少。结论1.与非糖尿病组相比,糖尿病组大鼠中心和外周血压显著升高,主动脉PWV、EM、中膜壁厚和中膜壁厚/胸主动脉内径比值显著增加,经GSPE治疗后能够显著改善糖尿病大鼠主动脉的功能。2.主动脉病理学显示:内皮细胞损伤、突起、形态不规则,中膜明显增厚,可见大量增殖的平滑肌细胞,平滑肌细胞和弹性纤维排列紊乱,PAS阳性物质多见,GSPE能够显著改善糖尿病大鼠主动脉内膜的损伤和中膜增厚。3.电镜显示:内皮下结构疏松,可见插入的平滑肌细胞,亚结构不清晰,经GSPE治疗后平滑肌细胞移行被显著抑制。第二部分基于蛋白质组学技术探讨GSPE对糖尿病大鼠主动脉的保护机制研究背景随着人类基因组计划工作的完成,生物医学领域已经开始在基因水平对各种疾病进行深入的研究,但人们也逐渐认识到基因只是遗传信息的载体,而生命活动的本质却是不同功能蛋白质在时间和空间上有序和协同作用的结果,蛋白质才是生理功能的执行者。传统的对单个蛋白质的研究方式已无法满足后基因组时代的要求,必须在整体水平上对蛋白质进行研究。只有对蛋白质数量、结构、性质、相互关系和生物功能全面认识,才能揭开生命现象的本质。因此,蛋白质组学已成为“后基因组时期”生物医学研究的重点内容之一。葡萄子原花青素（GSPE）是从葡萄子中提取的一种天然多酚类化合物,是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂之一,具有强大的抗氧化、抗非酶糖基化活性,并具有强效的心血管保护作用;其作为一种天然植物成分,无明显的毒性反应,在国内外的应用非常广泛。多年来,国内外众多学者一直致力于GSPE的作用机制研究。本课题组前期研究发现:GSPE对糖尿病大鼠主动脉组织具有显著的保护作用。但是,至今尚未明确GSPE治疗糖尿病大血管病变的分子靶点。目前,药物研发中共同存在的缺点是:只注重表型的观察和单个大分子或酶解活性,对药物的药理活性的观测常维持在分子水平上的简单理解,而除被检测的效应外,药物作用于潜在靶分子上的直接或间接的效应依然未知。为了弥补药理效应与分子水平上对效应理解之间的差距,完全有必要应用蛋白质组学技术研究药物的作用机制,发现新的药物治疗靶标,这些方法将极大地提高药物发现和药物研发的速度和效率,降低新药研发的成本。并且最近的研究证实,应用蛋白质组学技术能够全面理解药物作用的分子机制。本部分研究采用2-D荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE）和质谱技术分离鉴定正常对照组（C1组）、糖尿病未治疗组（DM1组）和糖尿病GSPE治疗组（DM2组）大鼠主动脉组织差异表达蛋白,阐述GSPE对糖尿病主动脉的保护机制,为临床上糖尿病患者并发症的治疗寻求和设计更为有效的药物提供候选靶点。研究目的1.深入研究糖尿病大鼠主动脉损伤的差异表达蛋白,进一步明确糖尿病大血管病变的病理生理机制;2.研究糖尿病大鼠经GSPE治疗后主动脉的差异表达蛋白,并筛选出药物的候选靶点,进一步揭示GSPE对糖尿病主动脉的保护机制。研究方法分别选取C1组、DM1组和DM2组大鼠各3只,提取主动脉总蛋白,并用DIGE染料Cy2、Cy3、Cy5标记样品蛋白质,然后利用2-D DIGE技术进行蛋白质分离（整个过程避光进行）:首先应用等电聚焦电泳（IEF）将蛋白质在不同PH梯度进行分离,并用SDS-PAGE电泳将蛋白质在不同分子量梯度上进行分离,然后用Typhoon 9400扫描仪获取2D-DIGE胶的荧光图像;应用DeCyder5.0软件系统进行图像分析,寻找各组样品的差异表达蛋白。C1组、DM1组、DM2组样品分别取1.5mg不进行标记按常规方法进行制备双向电泳,获得制备胶并用考马斯亮蓝染色,进行质谱鉴定。本实验首先使用AutoflexⅡMALDI-TOF/TOF质谱仪分析,质谱仪的紫外光的频率为200Hz,波长355nm,加速电压20KV,质量分辨率最大可达到1500Da,质量扫描范围是700Da-3200Da,基质为HCCA（10mg/ml）,用FlexAnalysis 2.4软件产生搜库所需二级质谱图,用BioTools 3.0软件,打开样品的原始谱图,设定参数,重新标峰,自动链接Mascot（http://www.matrixscience.com）网页,并进行搜索,选择使用的数据库为NCBI上大鼠的非冗余库（NCBInr20070518;4927571 sequences,1702359384 residues）。对于MALDI-TOF/TOF质谱仪未定鉴定出来的蛋白点,使用Finnigan线性离子阱串联质谱仪进行液相色谱一串联质谱仪（LTQ-ESI-MS/MS）分析。质谱仪配置C-18反相色谱柱,流动相（Mobile phase）A和B分别为0.1%溶于超纯水及乙睛中的甲酸,搜索使用的数据库为IPI上大鼠的非冗余蛋白库（IPI.RAT v3.15.1）。应用EXPASY蛋白质组学工具分析等电点、分子量及总平均亲水性,采用GO分类工具,从生物学途径、细胞组件及分子功能三方面对蛋白质表达谱进行功能分析及分类。研究结果1.2-D DIGE图谱本实验共获得5张2-D DIGE图谱,每张图谱分离出的蛋白质点数目从1279-1563不等。经过DeCyder软件系统分析,DM1组与C1组之间共获得差异蛋白29个。另外,C1组、DM1组、DM2组样品分别不进行标记按常规方法进行制备双向电泳,获得3块制备胶,用考马斯亮蓝染色并与2D-DIGE图像进行匹配。2.质谱鉴定结果本实验经MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定C1组和DM1组大鼠主动脉差异表达蛋白6个,经LTQ-ESI-MS/MS质谱仪鉴定主动脉差异表达蛋白19个。两种质谱仪共鉴定C1组和DM1组大鼠主动脉差异表达蛋白25个,其中糖尿病大鼠主动脉组织表达上调的点17个,下调的点8个,其中糖尿病大鼠经GSPE治疗后回调的差异表达蛋白16个。3.差异蛋白质定位分析对质谱鉴定得出的25个差异蛋白点（C1组和DM1组之间）和GSPE治疗后回调16个差异蛋白点经过ExPASy蛋白质组学工具分析,STZ诱发的糖尿病大鼠主动脉的差异蛋白包括胞浆蛋白、分泌蛋白、线粒体蛋白、膜蛋白、核蛋白和过氧化物酶体蛋白,其中以胞浆蛋白为主,占40%;糖尿病大鼠主动脉经GSPE治疗后回调的差异表达蛋白胞浆蛋白、分泌蛋白和线粒体蛋白均占25%。4.差异蛋白质功能分析我们根据已有知识、数据库注释和文献资料,以GO分类对质谱鉴定得出的25个差异蛋白点（C1组和DM1组之间）和GSPE治疗后回调16个差异蛋白点进行功能分析。在STZ诱发的糖尿病大鼠主动脉的差异蛋白中,细胞代谢所占比例最大,为36%。此外,糖尿病大鼠主动脉经GSPE治疗后回调的差异表达蛋白中,仍以细胞代谢所占比例最大,为30%,细胞增殖为第二位,占18%。结论1.获得了稳定可靠的各组大鼠主动脉组织的2-D DIGE图谱,并得到各组的差异表达蛋白。2.质谱鉴定C1组和DM1组大鼠主动脉差异表达蛋白25个,其中糖尿病大鼠经GSPE治疗后回调的差异表达蛋白16个。3.差异蛋白质定位分析:糖尿病大鼠及其经GSPE治疗后回调的差异蛋白均以胞浆蛋白为主。4.差异蛋白质功能分析:糖尿病大鼠及其经GSPE治疗后回调的差异蛋白均以细胞代谢所占比例最大。