化疗引起毛囊组织损伤的分子机制研究

论文摘要

目前对癌症的治疗主要采用的是手术切除、放疗和化疗。虽然化疗药物（如环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶）能杀伤和抑制肿瘤的生长,然而,化疗的同时会引起一些正常组织损伤等副作用,其中最明显的就是脱发。但目前,化疗引起脱发的分子机制还不是很清楚,已有报道,化疗诱导脱发的主要原因是p53依赖的Fas途径,引起毛囊细胞的细胞凋亡。我们利用全基因组测序技术比较注射环磷酰胺（Cyclophosphamide, CYP）后不同时间点小鼠皮肤全基因组水平基因表达的差异结果显示,sonic hedgehog （Shh）及其信号通路相关基因的表达水平从注射CYP后第一天开始就受到明显抑制,而p53及其下游p21和Fas等基因表达量并没有变化。shh信号对毛囊的形态发生和毛发的再生至关重要,我们用羽毛发育系统进行进一步研究,因为shh在羽毛的羽轴中并不表达,而只在羽枝分支处表达,结果发现注射CYP并不会使羽毛脱落,只会使羽支脱落,对注射CYP的小鼠补充外源shh蛋白在一定程度上能缓解化疗后的脱发。而western blot结果分析也发现,与p53有关的周期蛋白化疗前后并没有变化,同时用p53-/-的小鼠也观察到,p53的缺失并没有阻止小鼠的脱发。这些结果充分证明了,shh及其信号通路是化疗引起脱发的关键靶基因。通过BrdU细胞增殖实验发现,化疗诱导的组织损伤是因为shh依赖的细胞增殖被抑制。结合前人的研究结果和全基因组表达谱分析发现,细胞周期调控蛋白N-myc、CDC25可能受到shh的调控。用化疗药处理AGS细胞体外实验证实,shh在受到化疗药处理后很快会下降,下降的shh进一步下调N-myc、CDC25的表达,导致细胞增殖的抑制。我们还发现,其他会导致脱发的化疗药物与CYP的作用机制一致。综上所述,本论文发现了化疗药物作用的靶位点,揭示了化疗引起毛囊组织损伤的的相关分子机制,为肿瘤的治疗和药物的开发提供了新的思路和方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究背景
• 1.2 化疗引起脱发的研究现状
• 1.3 研究依据
• 1.4 shh信号通路简要介绍
• 1.5 shh信号在毛发发育中的作用
• 1.6 研究目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 药品与仪器
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 抗体来源
• 2.1.2.1 一抗
• 2.1.2.2 二抗
• 2.1.3 qRT-PCR引物
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.1.5 溶液成分及配方
• 2.2 实验材料
• 2.3 主要实验方法
• 2.3.1 小鼠拔毛
• 2.3.2 石蜡切片
• 2.3.3 石蜡切片HE染色
• 2.3.4 石蜡切片的免疫荧光染色
• 2.3.4.1 脱蜡与水洗
• 2.3.4.2 抗原修复与封闭
• 2.3.4.3 抗体的孵育与观察
• 2.3.5 Trizol方法提取RNA与蛋白
• 2.3.5.1 取样
• 2.3.5.2 总RNA的提取
• 2.3.5.3 总蛋白的提取
• 2.3.6 western blot步骤
• 2.3.6.1 蛋白的提取
• 2.3.6.2 蛋白浓度的测定
• 2.3.6.3 蛋白SDS-PAGE电泳
• 2.3.6.4 转膜
• 2.3.6.5 封闭与抗体的孵育
• 2.3.6.6 曝光显色
• 2.3.7 原位杂交步骤
• 2.3.7.1 探针的制备
• 2.3.7.2 探针的孵育
• 2.3.7.3 地高辛抗体的孵育
• 2.3.7.4 显色与观察
• 2.3.7.5 封片拍照
• 2.3.8 细胞培养与转染
• 2.3.8.1 细胞的培养相关方法
• 2.3.8.1.1 细胞的培养
• 2.3.8.1.2 细胞的传代
• 2.3.8.1.3 细胞的冻存
• 2.3.8.1.4 细胞的复苏
• 2.3.8.2 磷酸钙转染的相关方法
• 2.3.8.3 AGS细胞的培养与药物的处理
• 2.3.9 RNA的反转录
• 2.3.9.1 DNA的消化
• 2.3.9.2 DNase I的灭活
• 2.3.9.3 cDNA的合成
• 2.3.10 Real-time RT-PCR
• 2.3.11 小鼠基因型鉴定
• 2.3.11.1 小鼠尾巴的消化及DNA的提取
• 2.3.11.2 小鼠基因型鉴定PCR反应体系
• 2.3.11.3 小鼠基因型鉴定PCR引物
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 化疗会引起毛囊组织损伤
• 3.1.2 化疗会引起毛囊shh基因下调
• 3.1.3 化疗只对shh依赖的细胞有影响
• 3.1.4 补充外源shh蛋白能在一定程度上缓解CIA
• 3.1.5 shh也是其它引起CIA药物的靶基因
• 3.1.6 shh基因的下调引起细胞增殖受阻而非p53途径
• 3.1.7 N-myc和CDC25参与因shh下调而导致的细胞增殖抑制
• 3.2 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历