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ERK1/2信号通路对genistein和equol雌激素效应的影响

2020-12-07阅读(606)

ERK1/2信号通路对genistein和equol雌激素效应的影响

论文摘要

MAPK信号转导通路的异常与多种肿瘤或增殖性疾病关系密切。现已在哺乳动物细胞克隆和鉴定了4个MAPK亚族: ERK1/2、ERK5、JNK和p38 MAPK,其中ERK1/2与乳腺癌最相关。在MCF-7乳腺癌细胞中,ERK1/2激活是雌二醇诱导的细胞增殖关键信号转导事件。雌激素在乳腺癌细胞中的增殖效应主要是通过雌激素受体机制。genistein和daidzein是两种存在于大豆中的主要异黄酮成分,equol是daidzein的关键代谢物,由于它们可能作为激素替代治疗的天然替代物,减轻绝经后综合症,所以受到广泛关注。雌激素和异黄酮类植物雌激素的经典基因组效应是通过雌激素受体-激素复合物结合靶基因启动子区特异雌激素反应元件,转录激活响应基因;雌激素也可通过其它转录因子激活靶基因而不依赖于雌激素反应元件。最近研究显示,细胞表面受体能快速响应雌激素和植物雌激素。这些膜相关雌激素受体和细胞信号通路（如MEK/ERK和PI3K通路）交互作用,从而启动非基因组效应。信号转导通路可连接雌激素基因组效应与非基因组效应。这种从非基因组到基因组信号机制不同于雌激素受体（ER）作用于替代反应元件调控转录。ERα是许多乳腺癌生长的主要调控点,提供可能的治疗靶点。更好的理解ER机制以及ER和ERK1/2信号通路的交互作用可以为激素依赖型乳腺癌治疗提供更有针对性策略,以及对认识膳食中的雌激素样物质对激素依赖型乳腺癌患者的健康效应以及正确指导乳腺癌患者膳食选择均具有重要意义。目的:以激素依赖型乳腺癌细胞为模型,研究ERK1/2信号通路对genistein和equol雌激素效应的影响,探讨ERK1/2信号通路与ERα介导转录激活的关系。方法:采用噻唑蓝（MTT）比色法检测genistein和equol以及联合信号通路抑制剂对激素依赖型MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测genistein和equol以及联合ER拮抗剂与MEK1/2抑制剂处理细胞48后细胞周期变化;实时定量PCR检测genistein和equol以及联合ERα拮抗剂与MEK1/2抑制剂处理细胞后ERα靶基因pS2、GREB1和EEIG1的表达;Western blotting检测genistein和equol以及联合雌激素拮抗剂ICI、MEK1/2抑制剂U0126对ERα和ERK1/2信号蛋白表达的影响;应用报告基因方法检测genistein和equol以及联合ERα拮抗剂与MEK1/2抑制剂处理MDA-MB-231细胞24h后雌激素反应元件报告基因活性结果:MTT及流式细胞分析结果显示,生理浓度的genistein和equo（l0.01-10μM）促进MCF-7乳腺癌细胞增殖和S期进程。这些作用能被ERα拮抗剂OHT、ICI以及MEK1/2抑制剂U0126阻断,说明这种促进效应涉及到ER依赖机制和MEK/ERK信号通路。报告基因实验结果显示U0126能完全阻断genistein和equol诱导的ERα转录活性;实时定量PCR检测结果显示, genistein和equol能诱导ERα靶基因pS2、GREB1和EEIG1的表达,呈现时间效应,而且这种诱导作用能被ERα拮抗剂以及MEK1/2抑制剂阻断;提示MEK/ERK信号通路是ERα介导的转录所需要的。Western blotting检测结果显示genistein和equol诱导延迟ERK1/2激活,U0126能阻断ERK1/2激活,并且能进一步减少genistein和equol介导的ERα蛋白表达;而抗雌激素ICI对genistein和equol介导延迟的ERK1/2激活没有影响,这表明ERK1/2激活可能位于ERα介导的信号通路的上游。结论:低浓度的genistein和equol是通过ERα介导转录和ERK1/2激活促进细胞增殖和细胞周期进程,延迟而稳定的ERK1/2激活是genistein和equol诱导ERα转录活性所需要的。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 细胞株
  • 1.2 质粒和菌株
  • 1.3 试剂与试剂盒
  • 1.4 抗体
  • 1.5 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 细胞培养
  • 2.2 MTT 实验
  • 2.3 细胞周期
  • 2.4 Real-time PCR
  • 2.5 Western blotting 分析
  • 2.6 质粒的获取
  • 2.7 报告基因实验
  • 结果
  • 1 gensistein 和equol 的雌激素效应
  • 1.1 genistein 和equol 对MCF-7 细胞增殖影响
  • 1.2 genistein 和equol 对雌激素受体靶基因表达影响
  • 1.3 genistein 和equol 对雌激素受体表达影响
  • 2. 筛选参与genistein 和equol 雌激素效应的信号通路
  • 2.1 信号通路对genistein 和equol 介导的细胞增殖影响
  • 2.2 信号通路对genistein 和equol 诱导的ER 靶基因表达影响
  • 3 genistein 和equol 对ERK1/2 蛋白磷酸化表达影响
  • 4.M EK/ERK 信号通路对genistein 和equol 雌激素效应的影响
  • 4.1.M EK/ERK 信号通路对genistein 和equol 介导细胞增殖影响
  • 4.2.M EK/ERK 信号通路对genistein 和equol 介导细胞周期影响
  • 4.3.M EK/ERK 信号通路对genistein 和equol 介导ERα转录活性影响
  • 4.3.1 信号通路对genistein 和equol 诱导ER 靶基因的影响
  • 4.3.2 信号通路对genistein 和equol 介导的ERE 报告基因活性影响--
  • 4.3.3 信号通路对genistein 和equol 介导的ERα蛋白表达影响
  • 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 附录
  • 论著
  • 文献综述
  • 参考文献
  • 主要缩略词中英文对照
  • 致谢

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