禽流感病毒M2e基因多拷贝串联体的原核表达及免疫原性研究

论文摘要

高致病性禽流感（HPAI）是由H5和H7亚型禽流感病毒（AⅣ）引起的禽类急性高致病性传染病,被国际兽疫局（OIE）列为A类疾病,在我国被列为一类传染病。防控禽流感最有效的措施是免疫接种,但由于禽流感病毒容易变异,存在众多的血清亚型,并且各亚型之间没有交叉保护力,当前使用的疫苗必须在每年流行之前更新换代。因此,研制一种可以抵抗多种亚型禽流感病毒的“通用型”疫苗是当务之急。禽流感病毒基质蛋白2的膜外部分（M2e）在各个亚型之间高度保守,能够引起交叉保护,是研究“通用型”禽流感疫苗理想的靶抗原。将人工合成M2e基因（H9N2）与质粒pET-32a-M2e-Fc（H5N1）中的M2e-Fc基因串联至psIMPLE载体中,并利用同尾酶将串联体进行多拷贝的重复,最终成功构建含1、2、3、4、5、6拷贝M2e串联体的克隆载体,并将多拷贝的串联体亚克隆至表达载体pET-32a中,经过酶切鉴定和测序,证实其插入的片断大小、读码框架正确,结果获得6个表达载体,分别命名pET-（H9M2e-H5M2e）1-FcpET-（H9M2e-H5M2e）2-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）3-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）4-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）5-Fc、pET-（H9M2e-H5M2e）6-Fc。将6种表达载体转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,结果为6个重组质粒表达蛋白相对分子量分别约为40.9、47.0、53.1、59.3、65.3和71.4 kDa。将2、4和6拷贝基因重组质粒表达蛋白通过镍亲和层析,结果得到纯化的融合蛋白（H9M2e-H5M2e）2-Fc、（H9M2e-H5M2e）4-Fc、（H9M2e-H5M2e）6-Fc,分别简写4M2e、8M2e和12M2e,经Western-blotting鉴定融合蛋白具有良好的抗原性,为研究重组蛋白的免疫原性奠定了基础。利用纯化的3种重组蛋白4M2e、8M2e和12M2e分别与弗氏佐剂、白油佐剂和CpG佐剂进行乳化制备疫苗,取21日龄AⅣ阴性鸡分组进行动物免疫实验。其中三种蛋白分别与弗氏佐剂乳化分别为A、B和C组,蛋白12M2e与白油佐剂、CpG佐剂分别为D、E组,12M2e的全菌蛋白为F组,阴性组为G组,每组10只,免疫方式为肌肉注射,免疫剂量为50ug/只鸡,免疫两次,首免3周后加强免疫。首免后每周采血,用间接ELISA方法检测M2e特异性抗体滴度;分别在首免3周、加强免疫后2周与4周检测外周血淋巴细胞的CD4+与CD8+T细胞所占的比例;选取高滴度抗体试验组的血清进行了鸡胚中和试验、细胞病变试验和间接免疫荧光试验。结果显示,各实验组均产生了较高滴度的M2e特异性抗体,12M2e蛋白与弗式佐剂乳化疫苗组产生的抗体滴度最高,M2e特异性抗体在一定程度上能够中和H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚,并且这种抗体能够与表达在感染禽流感病毒的MDCK细胞表面的M2e发生反应,抑制MDCK细胞上病毒的释放。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 文献综述
• 第一章 禽流感病毒及其研究进展
• 1 禽流感病毒（AIV）的形态结构
• 2 AIV的基因组及其编码的蛋白质
• 2.1 编码RNA聚合酶的基因片段（PB1、PB2、PA）
• 2.2 血凝素（Hemagglutinin,HA）基因及其编码蛋白质
• 2.3 核衣壳蛋白（Nucleoprotein,NP）基因及编码的核蛋白
• 2.4 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）基因及其编码的蛋白
• 2.5 基质蛋白（Matrix,M）基因及编码的蛋白
• 2.6 NS基因及其编码非结构蛋白
• 3 AIV复制的分子机制
• 3.1 病毒的吸附、穿膜和脱壳
• 3.2 病毒基因组的复制及其他成分的合成
• 3.3 病毒粒子的装配
• 3.4 病毒的出芽和释放
• 4 禽流感病毒毒力和宿主特异性的分子生物学基础
• 5 禽流感病毒的遗传变异
• 6 小结和讨论
• 参考文献
• 第二章 禽流感疫苗的研究进展
• 1 全病毒灭活疫苗
• 2 弱毒活疫苗
• 3 亚单位疫苗及表位疫苗
• 4 重组活载体疫苗
• 5 核酸疫苗
• 6 小结
• 参考文献
• 第三章 流感病毒基质蛋白2的研究进展
• 1 流感病毒M2蛋白的结构及功能
• 2 M2作为保护性抗原的研究进展
• 3 M2蛋白诱导的保护性免疫应答的作用机理研究
• 4 小结和展望
• 参考文献
• 第四章 禽流感M2e基因多拷贝串联体的构建及其在大肠杆菌中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 质粒pET32a-H5M2e-Fc的酶切
• 2.2 质粒pSIMPLE-H9M2e的酶切处理
• 2.3 M2e基因多拷贝串联体中间克隆载体的酶切鉴定
• 2.4 M2e基因多拷贝串联体表达载体的酶切鉴定
• 2.5 表达融合蛋白的SDS-PAGE
• 2.6 诱导条件的优化
• 3.讨论
• 参考文献
• 第五章 禽流感M2e基因多拷贝串联体融合蛋白的免疫原性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 抗体水平测定结果
• 2.2 中和试验结果
• 2.3 间接免疫荧光试验
• 2.4 外周血淋巴细胞的亚群测定
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢