人巨细胞病毒（HCMV）pp65基因的克隆、原核表达及抗原性研究

论文摘要

人巨细胞病毒（HCMV）含有约20-25种蛋白质,其中在介导HCMV感染和病毒复制中有3种蛋白作用最为重要,即由ORF UL83编码的pp65蛋白、ORF UL82编码的磷蛋白pp71和ORF UL69编码的pUL69蛋白。上述3种蛋白共同的特点是启动HCMV对宿主细胞的感染和病毒的复制,同时在逃逸T淋巴细胞介导的细胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明,在这3种间层蛋白中以ORFUL83编码的蛋白pp65的作用最为显著,该pp65蛋白单独存在时,是一种较强的抗原蛋白,可刺激机体产生抗体,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV的感染后pp65蛋白的产生可以明显增强细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达,从而引起移植物血管病变和排斥反应;在视网膜母细胞瘤,pp6蛋白的产生可以引起肿瘤蛋白p105,p107,p130等的衰变。pp65蛋白可以诱导静止的细胞进入细胞周期并使他们停在G1晚期,而这段时期对病毒复制最为有利,所以它能够增加病毒繁殖,加快病毒在细胞间传递,体外将HCMV转染人纤维母细胞后,病毒DNA复制效率在共转染ORF UL83（pp65蛋白）条件下,感染及复制效率增加80倍。研究证实pp65不仅对HCMV的IE1和IE2基因表达有促进作用,而且对晚期基因的表达以及病毒向正常宿主细胞的传播具有促进和加强作用。因此,Baldick指出,ORF UL83（pp65蛋白）可作为抗CMV病毒药物设计的有效靶点。 本研究进行了以下工作: 1.人巨细胞病毒pp65基因的克隆及pET32-pp65重组表达质粒的构建 （1） 利用蛋白酶K法提取HCMV DNA。 （2） 设计引物、PCR扩增pp65基因目的片段。 （3） BamH Ⅰ和Xho Ⅰ内切酶双酶切目的片段和质粒pET32a（+）。并将pp65基因目的片段连接到pET32a（+）上,构建成能融合表达pp65的重组质粒pET32-pp65。 （4） 提取重组质粒pET32-pp65,以BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切方法和PCR方法鉴定重组质粒,说明重组质粒构建成功。 2.pET32-pp65重组质粒在大肠杆菌中的表达及分离纯化 利用IPTG诱导重组基因获得了高效表达,当诱导温度为37℃、诱导时间4h、

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 人巨细胞病毒概述
• 1.2 HCMV pp65研究现状
• 1.3 本研究的目的与意义
• 第二章 重组表达质粒pET32a-pp65的构建
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 第三章 pET32a-pp65在大肠杆菌中的表达、纯化及抗原性分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 第四章 全文总结
• 参考文献
• 英文缩写一览表
• 附录
• 致谢
• 作者简介