论文摘要
研究背景卵巢癌具有腹膜内种植转移的特征。研究证实血管渗透性因子（Vascular permeability factor，VPF），又名血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在卵巢癌腹水形成中起关键作用。恶性腹水通常是肿瘤的晚期表现。一旦发生，患者的中位生存期大约仅为数周至数月，而一年生存率一般不超过10％。现阶段，针对恶性腹水的治疗手段较多，包括全身化疗、腹腔灌注化疗、放疗、腹腔内注射放射性同位素或生物反应调节剂等。虽然获得了一定疗效，但是，迄今为止还没有哪一种方法的疗效完全令人满意，同时往往还造成患者生存严重下降。因此，如何对这部分患者进行恰当的临床干预以使其有较好的生存质量，是目前临床肿瘤工作者面临的重要任务。癌性腹水的发生机制与肝硬化腹水的发生机制相比，有显著的不同。在肝硬化腹水形成中，患者体内水钠滁留、低蛋白血症是造成腹水的主要原因；而对于癌性腹水，早先曾认为是膈下淋巴丛引流减少所导致，但是近来的研究表明，肿瘤局部分泌的血管内皮生长因子（VEGF），又名血管渗透性因子（VPF），作用于腹膜及新生血管导致其通透性增强才是形成癌性腹水的主要原因。以VEGF为靶点，抑制新生血管形成和腹膜渗透性，减少腹水生成，可能成为治疗癌性腹水的新策略。目的本研究拟建立VEGF高表达的荷卵巢癌裸鼠腹水模型，观察贝伐单抗（抗-VEGF单克隆抗体）对卵巢癌腹水生成的抑制作用，并探讨其作用机制。研究贝伐单抗（Bevacizumab）联合化疗药物顺铂（DDP）对裸鼠腹水生成的联合效用，以其提高腹水治疗的靶向性，寻找更有效的生物化疗治疗腹水的临床方法。实验方法1、对人卵巢癌细胞OVCAR3和HEY-A8肿瘤细胞株进行传代培养，并用RT-PCR方法测定其细胞VEGF和OVCAR3细胞VEGFR的表达。2、用两种细胞株进行腹腔内接种，观察腹水形成情况，用贝伐单抗和化疗药物顺铂对成腹水的裸鼠进行干预。3、用ELISA法测定腹水中VPF／VEGF的含量，用5％的Evan蓝从裸鼠尾静脉注入后，用酶标仪540nm波长检测Evan蓝的吸光度，通过检测吸光度值间接反映Evan蓝的浓度，从而分析腹膜渗透性。4、用CD34抗体标记检测微血管密度来研究贝伐单抗、顺铂对VEGF高表达的人卵巢癌细胞实体瘤血管生成的影响。5、收集临床腹水标本，用ELISA法测定腹水中VEGF的含量，从临床患者腹水中VPF／VEGF浓度的具体情况来进一步验证VEGF在腹水生成中的重要作用。6、统计学处理：动物实验中的数据采用SPSS10.0软件中完全随机设计资料的单向方差分析（One-way ANOVA），多组间比较采用LSD法。临床标本部分患者年龄、两组患者腹水中VEGF含量采用独立样本t检验。结果1、OVCAR3和HEY-A8细胞的培养和鉴定。OVCAR3和HEY-A8细胞经过复苏、传代培养后，生长状态良好，细胞成团块生长，单个细胞体积大，OVCAR3细胞圆形透亮；HEY-A8呈分叶状，透光度非常好。分别用RT-PCR方法进行VEGF的定性检测，结果表明OVCAR3细胞VEGF呈强阳性表达；HEY-A8不表达VEGF。2、两种人卵巢癌细胞株裸鼠腹水模型的建立。分别用两种细胞株进行腹膜内接种，裸鼠（5至7周龄）腹腔内注射OVCAR3细胞悬液（共48只，每只注射体积200ul，含5×106个细胞）。另外，将HEY-A8卵巢癌细胞株接种至12只裸鼠腹膜腔内（每只200ul，含2×106个细胞），接种后观察腹部膨隆和体重变化。OVCAR3细胞种植后2周，裸鼠开始出现腹部膨隆，提示腹水形成。尸解后，OVCAR3裸鼠腹腔内可见腹水生成，并见腹膜、肠道、肠系膜和子宫的表面散在的瘤结节，而HEY-A8裸鼠无腹部膨隆等症状出现，无腹水形成。3、贝伐单抗、顺铂和贝伐单抗联合顺铂对裸鼠腹水瘤的作用。分别测定腹水体积、腹水中VEGF含量、腹膜渗透性（OD值）、肿瘤细胞和红细胞数、及腹膜内实体瘤组织的微血管密度。实验结果表明三个治疗组对腹水皆有抑制作用，贝伐单抗组，顺铂组，联合治疗组裸鼠腹水体积分别为：2.36±0.34，3.62±0.31，1.82±0.40；以贝伐单抗组和联合治疗组作用显著，尤以联合治疗组效果明显（p=0.000；p＜0.05）；腹水中红细胞和肿瘤细胞分别在107个／ml和106个／ml水平以上，对照组红细胞为78.83±7.63，贝伐单抗组，顺铂组、联合治疗组分别为49.33±6.15，63.67±9.83，34.00±14.27，各治疗组跟对照组相比差异明显，尤以联合治疗组差异显著（p=0.000；p＜0.05）；各治疗组跟对照组相比，腹水中红细胞明显少于对照组（p=0.000；p＜0.05）；对照组中肿瘤细胞为77.00±6.60；贝伐单抗组，顺铂组，联合治疗组分别为56.67±4.68，67.83±6.88，40.33±9.59，各治疗组跟对照组相比差异明显，尤以联合治疗组差异显著（p=0.000；p＜0.05）；贝伐单抗组、顺铂组、联合治疗组和对照组的腹水中VEGF浓度分别为193.3±10.09、402.0±11.59、138.8±10.28和411.2±10.80，贝伐单抗组较顺铂组和对照组明显减少腹水中VEGF含量；顺铂组和对照组之间无明显差异（p=0.154，p＞0.05）；而贝伐单抗和顺铂的联合治疗可加强对腹水中VEGF含量的抑制（p=0.000；p＜0.05）。在腹膜渗透性方面，结果显示贝伐单抗组腹膜渗透性的OD值明显低于顺铂组和对照组（p=0.000；p＜0.05），顺铂组和对照组及贝伐单抗组与联合治疗组之间无明显差异（p=0.078；p＞0.05），说明贝伐单抗可明显改善腹膜渗透性，顺铂对腹膜渗透性无明显影响。4、贝伐单抗、顺铂和贝伐单抗联合顺铂对肿瘤组织微血管密度的影响。实验结果表明：对照组MVD的平均值为33.00±3.74；顺铂组MVD平均值为31.50±3.08；贝伐单抗治疗组MVD平均值为21.67±2.73；联合治疗组MVD平均值为16.83±2.48。顺铂组和对照组之间无明显差异（p=0.404，p＞0.05）；贝伐单抗和联合治疗组之间显著差异（p=0.000；p＜0.05）；贝伐单抗和联合治疗组较对照组和顺铂组显著降低其微血管密度（p=0.000；p＜0.05）。5、临床患者腹水的VEGF含量说明VEGF在腹水形成中的关键作用。恶性腹水和非恶性腹水中VEGF水平分别为（1294.9±761.9）pg／ml、（224.6±198.6）pg／ml，两者具有显著性差异（p=0.000；p＜0.05）。结论1、高VEGF表达的OVCAR3及不表达的HEY-A8之间在致腹水能力上存在差异，可能与VEGF表达差异有关。2、在OVCAR3腹水瘤模型中，经贝伐单抗，顺铂、贝伐单抗和顺铂联合干预实验表明，贝伐单抗联合顺铂能显著抑制裸鼠腹水的生长；减少腹水中的VEGF含量；降低腹膜渗透性及减少腹水中肿瘤细胞及红细胞数，说明贝伐单抗和顺铂联合治疗可加强对腹水的控制。3、贝伐单抗联合顺铂可明显减少卵巢癌组织的MVD水平，说明二者联合可明显抑制卵巢癌组织的新生血管生成，进而抑制卵巢癌的生长和发展，延缓腹水的进一步形成。4、临床患者腹水中VPF／VEGF含量亦说明VPF／VEGF是腹水形成中的关键性因子，在临床上，临床工作者可以根据腹水中VPF／VEGF水平判断腹水的性质和指导治疗，VPF／VEGF可望成为腹水中的有价值的肿瘤标志物。