甘菊BADH基因启动子的克隆及瞬时表达分析

论文摘要

菊花[Dendronthema×grandiflora （Ramat.） Kitam.]是我国十大传统名花和世界四大鲜切花之一,在传统育种方面取得了巨大成果。近年来,菊花的转基因育种又成为菊花研究的热点,并已取得了初步成果。菊花的转基因研究所用的启动子多为花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子,该启动子为组成型启动子,不能调控其表达的时间、部位和强度,由于来自低等生物,也存在表达水平低的问题。组织特异性启动子的应用,虽然可以控制表达的部位,表达水平也大为提高,但仍不能调控其表达的时间和强度。诱导型启动子的应用则有希望解决这两个方面的问题。利用诱导型启动子与菊花观赏性状（如花期和花色等）相关的基因相融合,研究基因的表达规律,进而进行转基因育种,达到能人为控制花期、花色等观赏性状的目的,具有重要的理论和实践意义。甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因是植物体内甜菜碱合成途径中的重要基因,该基因的表达受干旱、盐、脱落酸等因素的诱导。而盐诱导是最容易施行的诱导措施。本文在分析了菊科植物BADH基因资源的基础上,从耐盐性较强的菊花近缘植物甘菊[Dendranthema lavandulifolium （Fisch. ex Trautv.） Makino]中克隆了4个BADH基因的启动子序列,并初步鉴定各序列均具有启动子功能,为进一步鉴定该启动子的表达机理,进而驱动与菊花观赏性状相关的基因进行转基因育种奠定了基础。主要研究结果如下:1.从北京及河北部分地区采集到24种耐旱、耐盐性较强的菊科野生植物,还收集了两个栽培种及两个菊花栽培品种,利用PCR-Southern的方法检测了上述植物中的BADH基因,从其中20个种（包括品种）中检测到该基因。并通过测序和序列分析,获得了菊科植物中BADH基因的基本信息,为进一步研究菊科植物中的BADH基因及其启动子奠定了基础。2.利用RT-PCR、PCR-RACE技术从甘菊中克隆了BADH基因的两个全长cDNA序列,分别命名为DlBADH1和DlBADH2（GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152）,序列长分别为1 821 bp和1 918 bp。由其核苷酸序列推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶高度保守的十肽（VTLELGGKSP）和与酶功能相关的半胱氨酸残基（C）。两序列与已发表的其它植物BADH基因的氨基酸序列的同源性在64%以上。半定量分析表明,甘菊BADH基因的表达受盐诱导。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 引言
• 2 植物BADH 基因研究进展
• 2.1 BADH 基因的研究简况
• 2.2 BADH 基因结构的分析
• 2.2.1 编码区结构的研究
• 2.2.2 非编码区序列研究
• 2.3 BADH 基因的表达特性
• 2.3.1 DNA 水平的差异
• 2.3.2 转录或转录后水平的表达
• 2.4 BADH 基因的进化及与植物系统进化的关系
• 2.5 讨论
• 3 菊科野生植物资源调查采集与分析
• 3.1 调查采集的方法、地点和种类
• 3.1.1 调查采集的方法
• 3.1.2 调查采集的地点
• 3.1.3 调查采集的菊科植物种类
• 3.2 植物的形态、生境、分布与调查采集地
• 3.3 耐盐耐旱性分析
• 3.4 观赏特性分析
• 3.5 应用前景
• 4 菊科植物BADH 基因的检测及其片段的克隆与分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 DNA 提取
• 4.1.2.2 PCR 扩增
• 4.1.2.3 Southern 杂交
• 4.1.2.4 扩增片段的测序
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 DNA 提取
• 4.2.2 阳性对照目的片段的测序验证
• 4.2.2.1 PCR 扩增和重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.2.2 序列测定与分析
• 4.2.3 探针的测序验证与标记结果
• 4.2.4 PCR 扩增与Southern 杂交结果分析
• 4.2.5 被克隆BADH 基因片段的序列分析
• 4.3 讨论
• 5 甘菊BADH 基因cDNA 的克隆与表达分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.1.2.1 甘菊总RNA 的提取
• 5.1.2.2 第一cDNA 近3′端的RT-PCR 扩增
• 5.1.2.3 第一cDNA 的3′RACE 扩增
• 5.1.2.4 cDNA 的5′RACE 扩增
• 5.1.2.5 第一cDNA 完整开放阅读框的扩增
• 5.1.2.6 第二cDNA 5′端延长序列的扩增
• 5.1.2.7 第二cDNA 的3′RACE 扩增
• 5.1.2.8 第二cDNA 完整开放阅读框的扩增
• 5.1.2.9 DNA 的回收、连接、转化与测序
• 5.1.2.10 序列分析
• 5.1.2.11 半定量分析用甘菊材料的盐处理
• 5.1.2.12 半定量RT-PCR-Southern
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 总RNA 提取方法的比较
• 5.2.2 甘菊BADH 基因的克隆结果与序列分析
• 5.2.2.1 第一cDNA 的克隆
• 5.2.2.2 第二cDNA 的克隆
• 5.2.2.3 甘菊BADH 基因cDNA 全序列的拼接与分析
• 5.2.3 甘菊BADH 基因半定量表达分析
• 5.3 讨论
• 6 甘菊BADH 基因启动子的克隆与序列分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 试验方法
• 6.1.2.1 甘菊总DNA 的提取
• 6.1.2.2 甘菊BADH 基因第一内含子的扩增
• 6.1.2.3 启动子克隆的第一次步移
• 6.1.2.4 第一次步移后的PCR 扩增
• 6.1.2.5 第二次步移
• 6.1.2.6 第三次步移
• 6.1.2.7 全长启动子的扩增
• 6.1.2.8 PCR 产物的回收、连接、转化与鉴定
• 6.1.2.9 DNA 序列测定与分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 第一内含子序列扩增结果
• 6.2.2 第一次步移结果
• 6.2.3 第一次步移后的PCR 扩增结果
• 6.2.4 第二和第三次步移的结果
• 6.2.5 全长启动子的扩增结果
• 6.2.6 启动子序列分析
• 6.2.6.1 启动子序列差异分析
• 6.2.6.2 转录起始位点的预测
• 6.2.6.3 顺式作用元件的分析
• 7 甘菊BADH 基因启动子表达载体的构建及瞬时表达分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.1.1 植物材料
• 7.1.1.2 菌种与载体
• 7.1.1.3 生化试剂
• 7.1.2 试验方法
• 7.1.2.1 表达载体的构建
• 7.1.2.2 甘菊和菊花无菌苗的培育
• 7.1.2.3 农杆菌叶盘侵染
• 7.1.2.4 组织化学染色法检测Gus 活性
• 7.2 试验结果
• 7.2.1 植物表达载体的构建
• 7.2.1.1 中间载体的构建
• 7.2.1.2 植物表达载体的构建
• 7.2.1.3 植物表达载体的鉴定
• 7.2.1.4 植物表达载体转入农杆菌
• 7.2.2 瞬时表达结果与分析
• 7.3 讨论
• 8 结论
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢
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