肝癌细胞乏氧环境下SCF的表达调控机制研究

论文摘要

目的肝细胞癌是常见的消化道恶性肿瘤。尽管包括手术和放疗化疗在内的治疗手段取得了明显进展,但肝细胞癌的预后并未获得显著改善。乏氧是实体肿瘤普遍的生长微环境,乏氧状态下肿瘤更易出现进展是临床治疗中所面临的难题,然而肿瘤细胞适应乏氧环境的机制尚不明确。对肿瘤细胞适应乏氧环境相关基因调控机制及功能的研究,有助于发现新的治疗靶点。先前的研究表明,乏氧微环境可以诱导SCF的表达,SCF是促进肿瘤增殖和血管新生的重要因子。本研究的前期工作发现：肝癌细胞在乏氧状态下出现SCF转录活性的增加,HIF和SCF的同步表达上调,同时在SCF启动子区存在低氧反应元件HRE。结合文献报道,我们推测SCF可能参与乏氧状态下肝癌细胞病理生理过程的调控。因此,本研究拟检测乏氧状态下HIF-1/HIF-2与SCF的调控关系；采用ChIP、双荧光素酶活性分析等,阐明HIF-1/HIF-2与SCF的相互作用形式以及HIF-1/HIF-2参与SCF基因转录调控机制；进一步结合临床资料、组织标本对HIF和SCF之间的关系加以证实；最后观察SCF对肝癌细胞,生长和血管新生过程的自分泌作用和旁分泌作用进行研究,通过揭示乏氧状态下SCF的调控机制及其功能,为临床治疗提供新的靶点。方法一、明确乏氧状态下肝癌细胞中SCF表达水平和乏氧诱导因子HIF-1/HIF-2与SCF的调控的上下游关系。1.本研究选择肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Bel 7402为研究对象。常规传代培养。乏氧处理采用1%O2、5%CO2、94%N2混合气体对密闭培养箱中的细胞进行培养2.应用细胞转染和RNA干扰技术下调HIF-lα/HIF-2α的表达；3.分别应用RT-PCR和Western blot检测不同处理条件肝癌细胞中SCF HIF-lα、HIF-2α、VEGF及内参β-actin基因和蛋白白表达情况；4. ELISA检测不同处理条件下细胞培养上清液中分泌型SCF表达情况;二、研究乏氧状态HIF-1/HIF-2与SCF的相互作用以及转录调控机制1.采用染色体免疫共沉淀技术（ChIP）明确HIF-1或HIF-2对SCF的调控形式；2.应用HIF-1/HIF-2的过表达载体、SCF基因启动子或突变的SCF基因启动子荧光素酶表达载体,共同转染肝癌细胞,采用双荧光素酶分析法,定量检测HIF参与SCF基因转录激活的能力；三、分析SCF在肝癌细胞中表达的病理生理意义1.首先收集临床资料完整的肝癌组织标本,采用免疫组化分析肝癌组织中SCF、HIF、新生血管标志物CD34的表达情况,进一步通过对临床资料的分析,探讨SCF表达水平对肝癌预后的影响；2.探讨SCF对肝癌细胞生长和血管新生过程的自分泌和旁分泌作用；结果乏氧信号可以诱导SCF mRNA和蛋白的表达,通过RNA干扰技术沉默乏氧诱导因子-2（HIF-2）的表达,可以同时抑制SCF的表达,而沉默HIF-1则没有此抑制效果；深入研究发现,HIF-2可以结合于SCF基因启动子区的乏氧反应原件（HRE）,并且可以直接上调SCF的表达；进一步通过临床组织病理学检测分析,HIF-2和SCF的表达和肝癌的组织病理学分级、TNM分期、静脉侵袭和伴发肝硬化密切相关；HIF-2和SCF在肝癌组织中高表达,并且表达水平呈正相关；SCF通过自分泌作用可以促进肝癌细胞的增殖,同时通过旁分泌作用促进血管内皮细胞的迁移和管状形成。结论SCF是促进肝癌增殖和血管新生的重要细胞因子；乏氧环境下HIF-2时调节SCF表达的关键转录因子；通过干预HIF-2和SCF信号通路,有可能成为治疗肝癌的潜在靶点。

论文目录

• 中文摘要
• Abstracts
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、肝癌细胞中乏氧微环境对SCF表达水平的影响
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 实验对象
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 常氧状态下SCF及HIF-1/2在肝癌细胞中的表达
• 1.2.2 乏氧状态下SCF及HIF-1/2在肝癌细胞中的蛋白表达
• 1.2.3 乏氧状态下SCF及HIF-1/2在肝癌细胞中的mRNA表达
• 1.2.4 RNA干扰HIF-1/2对SCF表达的影响
• 1.2.5 ELISA法检测培养上清中SCF蛋白的浓度
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、HIF-2调节SCF表达的分子机制研究
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 实验对象
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 HIF-2直接结合于SCF基因启动子区
• 2.2.2 HIF-2调节SCF转录的具体模式分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、SCF在肝细胞癌中表达的病理生理意义分析
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 实验对象
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 HIF-1/2及SCF在肝癌组织中的表达相关性及临床意义
• 3.2.2 肝癌细胞SCF受体c-kit表达测定
• 3.2.3 SCF促进肝癌细胞增殖
• 3.2.4 SCF促进HUVEC管状形成
• 3.2.5 SCF促进HUVEC细胞迁移
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 缺氧诱导因子HIF与恶性肿瘤
• 综述参考文献
• 致谢