论文摘要
隐花素是植物的蓝光受体,在植物中调节多种光形态建成,包括抑制下胚轴的伸长、子叶的伸展和调节植物的开花时间等,但隐花素依赖蓝光调节光形态建成的分子机制仍然不清楚。本文以拟南芥隐花素突变体（CRY:cry1-304,cry1cry2）和哥仑比亚野生型（col-4）幼苗为材料,采用蛋白质双向电泳分离技术、MALDI-TOF-TOF、离子阱质谱鉴定技术以及生物信息学分析等手段,对在不同光处理条件下拟南芥隐花素突变体和野生型幼苗的全蛋白质组和核蛋白质组进行比较蛋白质组学研究,目的是探讨拟南芥CRY、col-4光信号应答相关蛋白质,及其网络调控机制。研究结果如下:（1）提取生长在白光、蓝光和暗处理中的cry1-304、col-4 7天幼苗的全蛋白质,双向电泳分离蛋白质,经图像分析软件分析,在cry1-304和col-4之间找到44个差异蛋白质点,质谱鉴定到21个蛋白质。相对于cry1-304,在白光下有15个蛋白质点上调,6个蛋白质点下调;在蓝光下有17个蛋白质点上调,4个蛋白质点下调;暗处理中有7个蛋白质点上调,3个下调,9个不变,其余2个蛋白质点消失。这些蛋白质中有两个是未知功能的,其余的蛋白质有7个参与代谢反应并且其中是4个参与能量代谢、3个与抵抗压力相关、4个参与转录、2个与蛋白质合成有关、1个参与RNA合成、1个参与蛋白质折叠、1个与细胞运输机制的功能相关。用半定量RT-PCR分析了其中4个蛋白质点相对应的基因表达,结果发现有1个蛋白质水平的表达与相同处理下mRNA水平的表达相一致,另外3个蛋白质点的mRNA水平的表达与蛋白质水平的表达不一致,其原因可能是由于基因表达存在翻译后修饰。进一步利用Matlab2006的K-means聚类程序的功能对21个差异蛋白质的丰度数据进行聚类分析,依据野生型和突变体对光的反应可分别形成6类不同反应的蛋白表达方式。本实验为研究CRY1介导蓝光调节基因表达提供了一个新的研究方法系统,这些分析结果表明光控制拟南芥的发育是通过共调节许多相关基因的表达而实现的。（2）采用双向电泳技术分离cry1cry2和col-4的7天幼苗的全蛋白质,经图像软件分析找到127个差异蛋白质点,质谱鉴定出75个蛋白质点。在暗处理下,cry1cry2和野生型之间有67个蛋白质丰度发生变化,cry1cry2有18个蛋白质下调、49个蛋白质点上调;在蓝光处理下,cry1cry2有44个蛋白质点下调,24个上调;在红光处理下,有64个蛋白质点的丰度发生改变,39个下调和25个上调;野生型col-4用蓝光或红光处理,与暗处理比较,分别有40个和46个蛋白点的丰度具有两倍以上变化,而cry1cry2则分别有49个和40个蛋白质点表达丰度发生变化。数据库结果显示,这些在不同光处理下差异表达的蛋白质主要是参与碳水化合物代谢、能量代谢、细胞结构组成、抵抗压力和抗氧化、蛋白质的折叠和细胞壁的形成等功能而且亚细胞定位主要是在叶绿体和线粒体。我们的研究鉴定出了5个新的光反应蛋白,分别是磷酸丙糖表异构酶、甘油醛三磷酸脱氢酶A、果糖二磷酸醛缩酶、苹果酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶B,这些蛋白质在cry1cry2蓝光下的表达都减低。研究找到了7个与下胚轴生长相关的蛋白,它们是榭皮酮3-O-甲基转移酶、α木糖苷酶、枯草杆菌蛋白水解酶、甘氨酸脱氢酶、甘氨酸富于蛋白、甘氨酸羟甲基转移酶,并初步找到了一些与CRY功能相关的基因。进一步对75个鉴定到的差异蛋白质的丰度数据进行聚类分析,结果显示对不同光处理反应蛋白,野生型和双突变体都分为6类,野生型和双突变体的总聚类可以分为9类,而野生型和突变体在蓝光和红光下表达有差异的蛋白质其亲缘关系都较近。通过对突变体和野生型的聚类分析,我们首次论证了蛋白质表达图谱可用于研究各种突变体在不同光照条件下光应答之间的关系。（3）研究发现除了cry1cry2在蓝光下调节蛋白质表达外,在红光下蛋白质表达水平也有明显的差异。为了进一步检测隐花素是否在蓝光和红光下都调节相关基因的mRNA的表达而导致蛋白质丰度的改变,我们用RT-PCR和实时定量PCR检测了野生型和cry1cry2幼苗生长在暗、红光和蓝光下的CHS、CAB2、GDH和FNR等4个基因的mRNA的表达。结果表明cry1cry2在红光和蓝光下都影响GDH和FNR的mRNA水平表达的变化,它们的变化趋势与蛋白质变化趋势一样,在野生型的蓝光与暗处理的比较（B/D）或红光与暗处理的比较（R/D）中都增加而在相同比较下突变体cry1cry2中是降低或没变化。这些结果提示,隐花素除了本身特异的蓝光功能外,还具有调节红光受体光敏素从而调控基因表达的作用。（4）用双向电泳、MALDI-TOF-TOF质谱及离子阱质谱鉴定了col-4、cry1-304或cry1cry2核蛋白,发现3个细胞定位在细胞核的蛋白质,其中14-3-3类蛋白质（GF14）对比野生型在两种突变体中表达都是上调,该蛋白质预测具有蛋白质绑定的功能,定位于细胞核核膜,用荧光定位分析表明该蛋白质表达在细胞核内。这一结果为将来进一步研究CRY在核内的功能提供了有用的信息。本研究进一步证实,拟南芥CRY基因介导蓝光可以引起一系列蛋白质表达的改变。我们的结果还首次发现了隐花素除在蓝光下外在红光下也具有调节控制蛋白质和基因表达的作用。研究得出了拟南芥隐花素基因影响蛋白质表达比较全面的差异蛋白质表达谱。这些为进一步分析拟南芥隐花素CRY的功能奠定了良好的基础。