论文摘要
目的利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离帕金森病肝阳化风证、血虚生风证及健康人对照组外周血单个核细胞总蛋白,建立相应蛋白质组表达图谱。比较3组外周血单个核细胞蛋白质组的差异表达,对差异表达的蛋白质进行质谱分析和数据库搜索,初步确定帕金森病肝阳化风证和血虚生风证外周血单个核细胞中差异表达的蛋白质,为研究帕金森病,探讨中医证本质内涵提供科学依据。方法帕金森病肝阳化风证组、帕金森病血虚生风证组及健康人对照组均以葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法制备外周血单个核细胞并加以裂解。以BCA法测外周血单个核细胞蛋白浓度。双向凝胶电泳分离各组外周血单个核细胞蛋白质,考马斯亮蓝染色使凝胶中的蛋白质点可视化。扫描凝胶成像,以PDQuest软件对帕金森病肝阳化风证组、帕金森病血虚生风证组及健康人对照组外周血单个核细胞蛋白质组表达图谱进行差异分析,选定差异点进行MALDI-TOF质谱分析。Mascot软件搜索MSDB和SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。用RT-PCR方法对FBX4蛋白进行验证。结果1.获得了分辨率和重复性均较好的帕金森病肝阳化风证组、帕金森病血虚生风证组及健康人对照组外周血单个核细胞蛋白质组表达双向电泳考染图谱。健康人PBMC的平均蛋白质点数为（700±30）个,PD肝阳化风证（602±15）个,PD血虚生风证（577±28）个,以健康人组胶为参考胶进行胶间斑点匹配,其平均匹配点数PD肝阳化风证组为（552±16）个,平均匹配率为78.8%,PD血虚生风证组为（494±25）个,平均匹配率为70.6%。不同胶间蛋白质点的位置偏差在IEF方向为（2.85±0.48）mm,在SDS-PAGE方向为（2.69±0.37）mm。2.选取15个表达具有明显差异的蛋白质进行质谱鉴定。和健康组相比,15个蛋白在PD组表达降低（P＜0.05）,PD组中15个蛋白在血虚生风组比肝阳化风组表达明显减弱（P＜0.05）。15个蛋白其功能涉及细胞骨架（如Rho GDI-2、Talin-1、CAP-1）、抗氧化应激（如Prx-Ⅲ）、蛋白降解（如FBX4）、信号转导（如hnRNP-K、Transgelin-2）、细胞周期调控（如Rap1b、Rsu-1）等。3.利用RT-PCR对FBX4蛋白进行验证。FBX4在PD组比健康人组表达减弱。（P＜0.05）PD组里FBX4血虚生风组比肝阳化风组表达减弱。（P＜0.05）与蛋白质组学检测结果一致。结论1.建立帕金森病肝阳化风证组、血虚生风证组及健康人对照组外周血单个核细胞蛋白质组表达图谱。2.帕金森病肝阳化风证和血虚生风证患者和健康人的PBMC存在多个蛋白质表达差异,差异蛋白提示帕金森病为多蛋白表达异常所致。帕金森病肝阳化风与血虚生风存在多个差异表达蛋白,提示同病异证具有不同的物质基础（不同的蛋白质）。此为中医“证”本质研究奠定了科学基础。3.RT-PCR验证结果与蛋白质组学检测结果一致,证明了蛋白质组学技术的稳定性和结果的准确性。
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标签：帕金森病论文; 蛋白质组论文; 外周血单个核细胞论文;