谷氨酰胺合成酶基因Gln1-3在玉米自交系18-599（红）中的过量表达

论文摘要

玉米是我国三大粮食作物之一,也是重要的粮、经、饲三元作物,其需求量日趋剧增,培育和推广高产、优质、高效玉米新型品种仍是当前和未来玉米改良工作的重点,更是解决我国粮经饲问题的重要研究方向之一。氮素是植物生长发育过程必需的最大矿质营养元素,氮素的吸收与同化是植物生长发育中最重要的生理过程,因此,结合传统育种策略与转基因分子育种技术,提高无机氮同化有机氮如谷氨酰胺和谷氨酸等效率,增强植物吸收和利用氮营养能力,是培育作物氮高效吸收利用高产型品种的重要途径之一。谷氨酰胺合成酶是植物氮素同化利用的主要的限速酶。大量研究揭示,谷氨酰胺合成酶能有效促进植物对氮的吸收和利用,提高光合效率,进而增加产量,其中玉米Gln1-3能促进植株中的氮素转移到玉米籽粒中并进行再同化,从而增加籽粒数。因此,在玉米植株中过量表达谷氨酰胺合成酶基因Gln1-3可能具有提高玉米籽粒产量的潜能。本研究在课题组前期开展玉米高产基因研究的基础上,利用同源克隆的方法从玉米自交系18-599（红）中分离获得玉米谷氨酰胺合成酶Gln1-3基因的开放阅读框,并分别构建了由组成型启动子CaMV 35S启动子和Ubiquitin启动子调控的两个Gln1-3基因的植物表达载体,分别命名为Ubiquitin1301—Gln1-3和pcambia1301—Gln1-3。其后通过农杆菌介导法将以上2个载体转化到玉米自交系18—599（红）的胚性愈伤组织,通过抗性筛选和再生分化获得了抗性植株。经PCR鉴定、半定量RT-PCR、谷氨酰胺合成酶活力测定,表明目的基因Gln1-3已整合到玉米基因组中,并进行了有效表达。对T1代产量相关性状分析,表明转基因玉米植株具有增产的趋势。主要结果如下：1.利用同源克隆技术在玉米自交系18-599（红）中克隆获得目的基因Gln1-3的开放阅读框,全长大小1051bp,利用生物信息学手段进行同源性比对后发现该基因与玉米gs1-3 （X65928.1） mRNA序列同源性高达99%,有2个碱基发生突变,编码氨基酸序列与源序列之间没有发现氨基酸差异,酶的活性中心无影响。2.构建植物表达载体Ubiquitin1301—Gln1-3及pcambia1301—Gln1-3,分别含有单子叶植物中强表达的Ubiquitin启动子和在双子叶植物中强表达的CAMV 35S启动子,酶切分析和测序结果表明,表达载体中目的片段插入方向正确且无任何突变。3.利用农杆菌介导法转化玉米自交系18-599（红）胚性愈伤组织约2万个,经潮霉素抗性筛选获得6株抗性植株,6株均为转Ubiquitin1301—Glnl-3阳性植株。4.对T0代转基因幼苗进行PCR鉴定,结果表明以上6株抗性植株均为阳性转基因植株,证明外源目的基因已经整合到转基因玉米基因组中。对抽丝期T0代植株叶片进行谷氨酰胺合成酶检测,结果表明,与对照相比酶活有不同程度的提高。但经自交授粉后,由于天气原因仅4个Ubiquitin1301—Glnl-3的转化体成功收获了种子。5.对4个T1代株系进行PCR检测,其中来源于2个株系的4个T1代转基因植株被检测为阳性。对这4个植株RT-PCR表达检测结果揭示,转基因植株中的Glnl-3的在转录水平上表达量均不同程度地高于对照非转基因植株。转基因植株谷氨酰胺合成酶活性检测结果与半定量RT-PCR结果基本一致。6.对授粉后T1代转基因植株功能叶中氮含量和光合效率检测结果发现,而授粉后转基因植株功能叶氮含量和光合效率明显高于对照,说明Glnl-3基因的过表达确实提高了氮从叶片转运到籽粒中的效率,同时反馈提高了生殖生长后期的光合作用。7. T1代转基因植株产量相关性状检测结果表明,4个转基因植株中有2株与对照相比穗粗、百粒重有明显提高,证明目的基因Glnl-3有提高玉米籽粒产量的趋势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 转基因技术在玉米中的应用
• 1.1 转基因技术的应用
• 1.2 转基因的受体
• 1.2.1 外植体
• 1.2.2 悬浮细胞
• 1.2.3 原生质体
• 1.2.4 愈伤组织
• 1.3 常用的转基因转化方法
• 1.3.1 基因枪法
• 1.3.2 PEG法
• 1.3.3 显微注射法
• 1.3.4 电击法
• 1.3.5 花粉管通道法
• 1.3.6 农杆菌法
• 1.4 转基因的检测方法
• 1.4.1 PCR
• 1.4.2 Southern blotting
• 1.4.3 其它检测方法
• 1.4.4 Northern blotting
• 1.4.5 RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）
• 1.4.6 Western blotting
• 1.4.7 ELISA检测
• 1.4.8 酶活检测
• 2. 转基因玉米的研究进展
• 2.1 抗虫转基因玉米
• 2.2 抗病转基因玉米
• 2.3 抗除草剂转基因玉米
• 2.4 耐盐、耐旱转基因玉米
• 2.5 高品质转基因玉米
• 2.5.1 高淀粉转基因玉米
• 2.5.2 高蛋白、高赖氨酸转基因玉米
• 2.5.3 高植酸酶转基因玉米
• 3. 氮素对玉米的影响
• 4. 谷氨酰胺合成酶（GS）
• 4.1 GS同工酶的种类及在细胞中的定位
• 4.2 谷氨酰胺合成酶（GS）在分子生物学方面的研究进展
• 4.2.1 谷氨酰胺合成酶（GS）的基因及其编码的几种多肽
• 4.2.2 谷氨酰胺合成酶（GS）基因的结构
• 4.3 谷氨酰胺合成酶（GS）对植物的作用
• 4.4 谷氨酰胺合成酶（GS）遗传转化的研究进展
• 5 本研究的目的与意义
• 6 本研究的技术路线
• 第二章 实验材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 玉米材料
• 1.2 细菌、质粒和引物
• 1.3 培养基
• 1.3.1 幼胚培养基
• 1.3.2 愈伤组织培养基
• 1.3.3 细菌培养基
• 1.3.4 抗生素和激素
• 2 实验方法
• 2.1 谷氨酰胺合成酶Gln1-3基因的获得
• 2.1.1 同源克隆玉米Gln1-3基因
• 2.1.2 酶切片段的回收
• 2.1.3 目的基因克隆测序
• 2.2 表达载体Ubiquitin1301—Gln1-3的构建
• 2.2.1 质粒Ubiquitin1301的转化
• 2.2.2 质粒DNA的提取
• 2.2.3 目的表达载体的获得
• 2.2.4 酶切片段的回收
• 2.2.5 目的基因Gln1-3连入pMD19-T载体
• 2.2.6 E.coli的热激转化（无菌操作）
• 2.2.7 提取质粒DNA
• 2.2.8 酶切获得目的基因
• 2.2.9 酶切片段的回收
• 2.2.10 将目的基因基因谷氨酰胺合成酶Gln1-3连入表达载体Ubiquitin1301
• 2.2.11 E.coli的热激转化（无菌操作）
• 2.2.12 提取质粒DNA
• 2.3 表达载体pcambia 1301—Gln1-3的构建
• 2.3.1 35S启动子的获得
• 2.3.2 对表达载体Ubiquitin1301—Gln1-3的酶切
• 2.3.3 将35S启动子连入表达载体Ubiquitin1301—Gln1-3
• 2.3.4 E.coli的热激转化（无菌操作）
• 2.3.5 阳性单克隆检测
• 2.3.6 提取质粒DNA
• 2.4 植物表达载体质粒转化农杆菌
• 2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.4.2 表达质粒热激转化农杆菌感受态细胞
• 2.5 遗传转化
• 2.5.1 农杆菌介导的遗传转化
• 2.6 再生植株的分子检测
• 2.6.1 PCR检测
• 2.6.2 RT-PCR
• 2.6.3 按照调适各样品cDNA浓度进行目的基因PCR扩增电泳检测
• 2.6.4 谷氨酰胺合成酶（GS）酶活测定
• 2.6.5 光合作用、叶氮含量等生理指标的测定
• 2.6.6 T1代转基因种子产量性状鉴
• 第三章 结果与分析
• 1 目的基因Gln1-3的获得
• 2 表达载体Ubiquitin1301—Gln1-3的构建
• 3 表达载体pcambia1301—Gln1-3的构建
• 4 T0代再生植株的分子检测
• 5 T0代转基因性植株的谷氨酰胺合成酶活力检测
• 6 T1代转基因植株的分子检测
• 7 T1代转基因植株的半定量RT-PCR检测
• 8 T1代转基因植株的谷氨酰胺合成酶活力检测
• 9 T1代转基因植株授粉后功能叶含氮量检测
• 10 T1代转基因植株授粉后功能叶光合效率检测
• 11 T1代转基因植株产量性状
• 第四章 讨论
• 1 目的基因的生理功能及启动子对表达水平的影响
• 2 谷氨酰胺合成酶与氮转运效率、光合效率及产量性状的关系
• 3 关于谷氨酰胺合成酶酶活力测定
• 4 培育高产转基因玉米品种的方法探讨
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢