论文摘要
糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是指糖尿病（Diabetes mellitus，DM）微血管病变所引起的肾脏结构和功能的改变，是糖尿病常见和严重的远期并发症之一。世界范围内，随着DM发病率的增加DN日益增多，在西方国家DN已成为终末期肾脏病（End sta ge rena l disease，ESRD）的主要原因。在我国DM患病率也不断增高，据估计我国糖尿病患者已超过4000万。我国因DN而发生慢性肾衰竭的人数也逐年上升。DN的病理特征包括：早期的肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚及肾小球内高灌注、高跨膜压；病程进展可有肾小球细胞外基质积聚、肾小管间质纤维化。这些特征性病理变化是细胞外基质（Extracellula r Matrix，ECM）在肾小球系膜区以及肾小管间质堆积所致，而ECM的聚集与肾组织内单核/巨噬细胞（Monocytes/macropha ges）的广泛浸润有关。单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoa ttracta nt Protein-1，MCP-1）是单核巨噬细胞特异性的趋化因子，对单核巨噬细胞有很强的趋化激活作用。从Ⅰ型或Ⅱ型DN患者肾组织活检以及DN大鼠肾脏病理学检查中均确认MCP-1是单核巨噬细胞聚集的主要因素。在DM过程中，代谢和血流动力学的变化相互作用，促进DN的发生。其中多重因素都可刺激肾脏固有细胞、间质浸润细胞产生MCP-1。而MCP-1能趋化单核/巨噬细胞，激活粘附分子，诱导溶酶体的释放，活化TGF-βl，促进超氧阴离子和胶原的产生，对DN的进展起了重要作用。本实验所用药物是从云南文山三七中提取出的人参皂甙单体Rb1、Rg1，是三七总皂甙（Pana x notoginseng saponins，PNS）的主要活性单体。中医认为，三七性温、味甘、微苦，归肝、胃经，具有化瘀止血、活血定痛、补虚强壮的效果，兼活血补血之功效于一身。其主要活性成分是PNS，其中含20多种达玛烷型皂甙，与人参主要成分一致，即人参二醇型皂甙Rb1（Panaxad iolof saponin Rb1，Rb1）、人参三醇型皂甙Rg1（Panaxad iol of saponin Rg1，Rg1）。Rb1、Rg1具有多种生物学功能，现在的研究主要集中在抗肿瘤、抗氧化、诱导细胞凋亡以及扩张血管、抑制血小板聚集、延长凝血时间、抗炎等方面。中医理论认为DN属于中医学的“水肿”、“肾消”和“尿浊”等病症范畴，其病机特点是本虚标实。《内经》云“虚则补之、实则泻之”。虚实夹杂、正邪交争之病在治疗时最应谨慎。正所谓补虚防助邪，祛邪防伤正。三七活血化瘀、补虚强壮，兼活血补血之功效于一身，很切合DN的中医病机，一方面活血化瘀不伤正，一方面补血益气不助邪。另外研究还发现：不管是PNS还是其主要成分单体Rg1、Rb1，都具有明显的肾脏保护作用，对多种肾脏疾病都有减轻作用。本文通过整体动物实验和体外细胞实验，应用免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）、原位杂交法（In situ hybrid iza tion，ISH）、MTT法以及Western blot等方法从组织、细胞、蛋白质、基因水平进行研究，旨在探讨Rg1、Rb1防治DN的作用机制。目的：通过建立DN大鼠模型，从整体动物实验研究Rg1、Rb1是否能够有效的改善DN大鼠肾功能、延缓肾脏病理损伤，进而从组织、细胞、蛋白质、基因水平研究Rg1、Rb1对MCP-1表达的影响，以期阐明Rg1、Rb1防治DN的作用机制。方法：整体实验采用腹腔内一次性注射STZ复制DM大鼠模型。清洁级雄性SD大鼠75只，正常组10只，其余造模成功后随机分组，各组分别给予相应药物或蒸馏水灌胃治疗；1．每周测量大鼠体重，于第4、8、12周末分别留尿测24h尿蛋白。12周后处死大鼠，取血清检测生化指标。取肾脏称重，计算肾重/体重比；染色后观察大鼠肾脏病理学变化。同时采用病理评分标准评价各组大鼠肾组织病理改变。2．IHC：检测大鼠肾组织中MCP-1蛋白表达情况；3．ISH：检测肾组织中MCP-1mRNA的表达情况。细胞实验，采用肾小球系膜细胞（Glomerular mesa ngia l cells，GMCs）体外培养。除空白组外，其余各组均用高糖刺激，并应用相应的纯药，检测下列指标。1．MTT：检测Rg1、Rb1对高糖刺激12h，24h，48h和60h时GMCs增殖的影响情况。2．Western blot：检测Rg1、Rb1对高糖刺激48h时GMCs表达的MCP-1蛋白含量的影响情况。结果：1．各治疗组大鼠一般情况及肾脏病理损害与模型组相比均有所改善。其中，①体重：与模型组比较各治疗组大鼠体重各周均有所增加，但没有统计学差异。②肾重/体重比：与模型组比，Rb1组大鼠肾重/体重比减轻明显，有极显著性差异（P<0.01）；Rg1大、Rg1小也有减轻，有显著性差异（P<0.05）。③24h尿蛋白定量：与模型组比较，第4周、第8周Rg1大、Rg1小及Rb1组明显减轻，有极显著性差异（P<0.01）；第12周，Rg1大、Rg及Rb1组有显著性差异（P<0.05）。④血生化：Rg1、Rb1可以降低BUN、Scr与TG，与模型组比较，各治疗组BUN均有极显著性差异（P<0.01），Scr方面Rg1大及Rb1组有极显著性差异（P<0.01），Rg1小组有显著性差异（P<0.05）；TG治疗组均有降低趋势，但无统计学差异。Rg1、Rb1均可以减轻DN大鼠肾脏病理损害损伤指数。2．Rg1、Rb1可以减少肾组织MCP-1蛋白及其mRNA的表达，与模型组比较，Rg1小、大及Rb1肾组织MCP-1蛋白的表达均显著减少，具有极显著性统计学意义（P<0.01）；Rg1小、Rg1大及Rb1组大鼠肾组织MCP-1mRNA表达明显减少，其中Rg1大剂量组与模型组相比有显著差异（P<0.05）。3．Rg1、Rb1能够抑制高糖刺激的GMCs增殖，各时相点以Rg1大剂量抑制效果最好。4．Rg1、Rb1能够明显抑制高糖刺激的GMCs分泌MCP-1蛋白，其中Rg1大剂量、Rb1大剂量与高糖组相比有极显著性差异（P<0.01）。Rg1小剂量、Rb1小剂量与高糖组相比有降低，但无统计学意义。结论：1．初步的药效学试验发现：Rg1、Rb1对DN大鼠的肾脏损伤有肯定的改善作用。⑴Rg1、Rb1能显著改善DN大鼠的一般状况；能降低DN大鼠肾重/体重比；调整血脂，减轻24h尿蛋白排泄量，改善肾功能。⑵Rg1、Rb1能减轻DN大鼠肾脏病理学改变，减轻肾小球系膜区增宽、系膜细胞增生，肾小管管腔扩张、小管上皮细胞胞质减少、细胞萎缩或空泡变性以及减轻肾小球和肾间质纤维化等。2．进一步的机理研究发现：Rg1、Rb1防治DN大鼠肾脏损伤的机理可能主要在于以下两个方面：⑴Rg1、Rb1能够下调肾组织MCP-1蛋白及mRNA的表达。⑵Rg1、Rb1能够不同程度的抑制高糖刺激下的GMCs的增殖和MCP-1蛋白的表达。总之，Rg1、Rb1可以改善DN大鼠肾功能，减轻DN肾脏病理损伤。抑制GMCs的增殖和MCP-1蛋白的表达；下调肾组织MCP-1蛋白及mRNA的表达可能是Rg1、Rb1防治DN的机理之一。
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