恶性疟原虫abstrakt同源基因的克隆及食蟹猴疟原虫eIF-4A同源蛋白的cDNA克隆、表达和ATP酶活性研究

论文题目: 恶性疟原虫abstrakt同源基因的克隆及食蟹猴疟原虫eIF-4A同源蛋白的cDNA克隆、表达和ATP酶活性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物遗传育种与繁殖

作者: 宋平

导师: 李奎

关键词: 恶性疟原虫,食蟹猴疟原虫,真核翻译起始因子,解旋酶,序列分析

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: DEAD-box蛋白家族的ATP依赖的RNA解旋酶类参与细胞内几乎所有的RNA代谢过程,在几乎所有生物的细胞生长发育过程中扮演着众多不可或缺的角色。疟疾目前仍然是世界上许多地方的一个主要的健康问题;控制疟疾的一个可行的办法就是研制出通过阻断疟原虫生长有关的关键酶来抑制其生长的药物,比如通过阻断DNA/RNA解旋酶等。按照此思路,我们进行了有关疟原虫DNA/RNA解旋酶的研究。本研究主要开展了两个方面的工作:1.克隆了Plasmodium flaciparum abstrakt全长基因,分析了该蛋白的结构;并且依据不同DEAD-box蛋白的结构特征进行了初步归类。2.克隆了Plasmodium.cynomolgi eIF-4A完整cDNA,表达了该重组蛋白并对其ATPase活性进行了检测。 在本实验中,通过PCR和探针杂交相结合的筛选方法,筛选恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的基因组文库,克隆了FH1F—abstrakt同源基因的完整序列。通过搜索已经完成测序的恶性疟原虫基因组数据库,推测FH1F序列定位在第5条连锁群上。FH1F全长2804bp,包含一个1161bp的完整阅读框,编码一个由386个氨基酸组成的蛋白。对FH1F蛋白序列用Blast P进行搜索和分析以及用DNAStar与许多典型的DEAD-box蛋白序列进行比对分析,结果均提示FH1F蛋白应该是DEAD-box家族的一个Abstrakt蛋白。另一方面,用DNAStar对已知所有完整的DEAD-box蛋白进行详细的序列分析以及用Mega对这些序列进行系统发育研究的结果都显示: DEAD-box家族的蛋白聚类成为若干不同的亚家族;与DEAD-box蛋白的一般保守序列相比,Abstrakt,eIF-4A,Vasa,P68等不同亚群的DEAD-box蛋白在保守区具有各自不同的结构特征。本文对不同的DEAD-box蛋白的结构特征进行了总结并试图给出不同亚群分类上的结构标准,对Abstrakt蛋白在本应高度保守的位点上异常于其它DEAD-box蛋白的氨基酸残基的取代也进行了相关的初步分析。 采用同样的基因克隆方法筛选食蟹猴疟原虫(Plasmodium cynomolgi)的cDNA文库,克隆了一个eIF-4A同源蛋白的完整cDNA序列,命名为CH1F。CH1F全长1753bp,包含一个1197bp的完整阅读框,推测编码一个由398个氨基酸组成的蛋白。对CH1F的蛋白序列用BlastP进行搜索和分析,提示它应该是DEAD-box家族的一个eIF-4A同源蛋白;用DXAStar将其与许多典型的DEAD-box蛋白序列进行比对分析,结果显示:比起其它的DEAD-box蛋白,它与eIF-4A或eIF-4A的同源蛋白具有更高的一致性和更多序列上的相似结构域。将包含完整阅读框的片段亚克隆到表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌DH5α中表达,产生的融合蛋白大小在45kD左右。对该融合蛋白进行纯化、重新折叠和初步鉴定。ATP酶活性检测显示,该融合蛋白只有很低的ATP酶活性,而且它的ATP酶活性似乎不依赖于核酸底物。对这一检测结果给出3种

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

前言

1.文献综述

1.1 DEAD-box蛋白家族的结构特征

1.2 DEAD-box家族蛋白的功能

1.2.1 转录起始

1.2.2 mRNA前体的剪接

1.2.3 核糖体大小亚基的生物发生

1.2.4 RNA转运

1.2.5 翻译的起始

1.2.6 RNA降解

1.3 DEAD-box主要亚家族蛋白的研究进展

1.3.1 eIF-4A

1.3.2 p68

1.3.3 vasa和abstrakt

2.恶性疟原虫abstrakt同源基因的克隆及DEAD-box家族蛋白序列的分析

2.1 研究背景，研究目的和研究方案

2.1.1 研究背景与研究目的

2.1.2 研究方案

2.2 材料与方法

2.2.1 DNA文库和基因组文库

2.2.2 疟原虫的培养和纯化

2.2.3 DNA、RNA的提取及RNA的纯化

2.2.4 简并引物的设计及PCR扩增、DNA检测与纯化

2.2.5 PCR产物(目的DNA片段)的克隆

2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.7 DNA双脱氧测序

2.2.8 放射性同位素标记DNA探针的制备—随机寡核苷酸引物合成法

2.2.9 cDNA文库和基因组文库的筛选

2.2.10 Southern杂交分析

2.2.11 Northern杂交分析

2.2.12 序列分析

2.3 实验结果

2.3.1 CH1、FH1和FH2的克隆及其鉴定

2.3.2 FH1F全长基因的克隆及其鉴定

2.3.3 DEAD-box蛋白家族系统发生分析

2.4 讨论

2.4.1 在P.falciparum基因组中只含有一个FH1H拷贝

2.4.2 P.falciparum基因组含有多个不同的DEAD-box蛋白基因

2.4.3 FH1为探针的Northern杂交分析

2.4.4 P.falciparumabstrakt蛋白具有典型的abstrakt蛋白结构特征

2.4.5 不同亚家族的DEAD-box蛋白具有其亚家族的结构特征

2.4.6 PCR结合探针噬斑杂交方法可以大大提高筛选文库的速度和效率

3.Plasmodium cynomolgi eIF-4A的克降、重组蛋白的表达和纯化及其ATPase活性检测

3.1 研究背景、研究目的和研究方案

3.1.1 研究背景与研究目的

3.1.2 研究方案

3.2 材料与方法

3.2.1 有关试剂的配制

3.2.2 重组表达载体的构建

3.2.3 重组克隆的表达

3.2.4 表达蛋白的粗提取

3.2.5 Ni~(2-)柱亲和层析法纯化带His6标记的目的蛋白及其蛋白质复性

3.2.6 ATPase活性检测

3.3 结果

3.3.1 CHlF全长cDNA的结构

3.3.2 CHlF是eIF-4A同源物

3.3.3 重组蛋白CHlF的过量表达、纯化和鉴定

3.3.4 重组蛋白CHlF ATPase活性检测

3.4 讨论

3.4.1 cDNA克隆CHlF为eIF-4A；所表达的重组蛋白为eIF-4A同源物

3.4.2 重组蛋白CHlF ATP酶活性分析

结论

一、恶性疟原虫abstrakt同源基因的克隆及DEAD-box蛋白序列分析

二、食蟹猴疟原虫eIF-4A同源蛋白的cDNA克隆、重组蛋白的表达和纯化及其ATP酶活性检测

参考文献

附表1

在读期间发表论文题录

致谢

发布时间: 2005-12-05

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