抗伏马菌素B1单克隆抗体的制备及其ELISA检测试剂盒的研发

论文摘要

伏马菌素B1（FB1）是由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）产生且具有肺毒性、神经毒性、免疫系统毒性、致癌性等多种毒性的一类真菌毒素。FB1是一种污染范围较广的真菌毒素,主要污染玉米及其制品,也可污染小麦、稻米等粮食及其制品。由于FB1分布广泛且毒性较大,且对人类以及动物都能产生毒性,因此它在食品安全中越米越受到人们关注。国际癌症研究中心UARC)已经把F131确定为2B类致癌物（有可能使人类诱发癌症）。目前,对FB1的检测主要建立在仪器测量上,由于仪器设备价格昂贵且操作复杂,因此有一定局限性。以单克隆抗体为基础的免疫学检测方法不仅克服了上述难题,而且灵敏度更高,有利于推广普及。本研究利用实验室保存的能分泌抗FB1单克隆抗体的细胞株4G5,进一步筛选出能稳定分泌单抗且效价更高的细胞株4G5-A4,并制备纯化出抗FB1单克隆抗体。抗体纯化前蛋白浓度为12.58 mg/mL,纯化后抗体浓度为1.62 mg/mL, IgG回收率为25.63%,亚类为IgG2b,亲和力为1.28×108L/mol;单抗与AFB1、CIT、 CTX、DON没有交叉反应,与T2毒素有轻微的交叉反应现象。本研究获得的抗FB1单克隆抗体品种优良,为进一步建立FB1的ELISA检测技术奠定了基础。利用所获得的抗FB1单克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,优化参数条件。其中抗原包被浓度0.05 μg/mL,一抗稀释度为1：4000。该检测方法对FB1的检测线性范围为1.29～804.38 ng/mL,最低检出限为0.27 ng/mL。模拟样品加标回收平均回收率在96.561%-109.025%之间,变异系数均小于10%。实际样品中检测出的FB1平均浓度为195.80 ng/mL,最大浓度为355.95 ng/mLo本研究建立的检测方法,在一定程度上能适用于玉米以及玉米制品的安全检测和风险评估。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 引言
• 1.1 伏马菌素性质及危害
• 1.1.1 伏马菌素的理化性
• 1.1.2 伏马菌素产生菌
• 1.1.3 伏马菌素的毒性
• 1.1.4 伏马菌素的污染现状
• 1.2 伏马菌素的检测方法
• 1.2.1 薄层层析法（TLC）
• 1.2.2 气相色谱法（GC）
• 1.2.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.2.4 液相色谱质朴联用法（LC-MS/MS）
• 1.2.5 酶联免疫分析法（ELISA）
• 1.2.6 其他检测方法
• 1.3 单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）的研究背景
• 1.3.1 单克隆抗体技术原理
• 1.3.2 单克隆抗体的应用
• 1.4 小结
• 第二章 伏马菌素当克隆抗体的制备和鉴定
• 引言
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂与药品
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 培养液及配置试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 杂交瘤细胞的复苏
• 2.2.2 杂交瘤细胞的筛选
• 2.2.3 阳性细胞的克隆化
• 2.2.4 杂交瘤细胞的冻存
• 2.2.5 单克隆抗体的制备
• 2.2.6 单克隆抗体的纯化与浓度的测定
• 2.2.7 透析袋的处理
• 1单克隆抗体效价的测定'>2.2.8 抗FB₁单克隆抗体效价的测定
• 2.2.9 单克隆抗体SDS-PAGE凝胶电泳检测
• 2.2.10 单克隆抗体亚类鉴定
• 2.2.11 单克隆抗体亲和力测定
• 2.2.12 单克隆抗体特异性的检测
• 2.3 结果
• 2.3.1 单克隆抗体细胞株筛选结果
• 2.3.2 腹水纯化及蛋白浓度测定
• 2.3.3 腹水效价测定
• 2.3.4 单抗亚类鉴定
• 2.3.5 单克隆抗体亲和力测定
• 2.3.6 单抗特异性测定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 杂交瘤细胞筛选及克隆化
• 2.4.2 单克隆抗体的纯化
• 2.4.3 单克隆抗体特异性检测
• 2.5 小结
• 1间接竞争ELISA检测方法的建立'>第三章 FB₁间接竞争ELISA检测方法的建立
• 引言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 仪器耗材
• 3.1.3 试剂配置
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 3.2.2 ELISA检测标准曲线的建立
• 3.2.3 ELISA检测方法的特异性评价
• 3.2.4 加标回收
• 3.2.5 实际样品检测
• 3.2.6 ELISA检测试剂盒的组装与使用
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 最佳包被模式的确定
• 3.3.2 最佳封闭液及封闭条件的确定
• 3.3.3 最佳酶标二抗浓度及作用时间的确定
• 3.3.4 最佳底物作用时间的确定
• 3.3.5 竞争标准曲线的建立
• 3.3.6 ELISA检测方法的特异性检测
• 3.3.7 加标回收检测
• 3.3.8 实际样品检测
• 3.3.9 ELISA检测试剂盒的组装
• 3.4 讨论
• 1的ELISA检测分析'>3.4.1 FB₁的ELISA检测分析
• 3.4.2 间接竞争ELISA检测特异性分析
• 3.4.3 间接竞争ELISA检测灵敏度分析
• 3.4.4 模拟样品检测分析
• 3.4.5 实际样品检测分析
• 3.5 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢