论文摘要
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段,即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段,血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质,是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成,原发肿瘤的生长不会超过1～2 mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因,而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中,血管生成均发挥着重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）家族成员主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D,其中VEGF-A、VEGF-B通过与肿瘤血管内皮细胞上的VEGF受体1（VEGFR1）的作用促进肿瘤血管生成,而VEGF-C、VEGF-D通过与肿瘤淋巴管内皮细胞上的VEGF受体3（VEGFR3）的作用促进新生淋巴管的形成。用可溶性受体阻断VEGF与VEGF受体的传导途径已被证实是一种行之有效的抗肿瘤治疗手段。实验结果表明可溶性VEGFR1能竞争性结合VEGF-A和VEGF-B,从而阻断肿瘤内新生血管的形成,有效地抑制肿瘤的生长和转移。可溶性VEGFR3可通过阻断VEGF-C和VEGF-D的生物学功能而抑制肿瘤内淋巴管生成,进而抑制肿瘤的淋巴转移。如能制备出能同时阻断肿瘤血管与淋巴管生成的大分子融合蛋白形式的双功能受体将具有重要的临床意义。在本研究中,我们率先设计了同时包含VEGFR1和VEGFR3功能域的基因工程双功能融合受体（VEGFR1/VEGFR3-Ig）,并在哺乳动物细胞表达系统中获得了高效表达。这种融合蛋白分子既能结合VEGF-A、VEGF-B,又能结合VEGF-C、VEGF-D,更加彻底地阻断VEGF/VEGFR传导途径,从而既能抑制肿瘤中血管内皮细胞分裂增殖、抑制新生血管的形成、降低血管通透性、减少肿瘤的供血和供氧,同时也可阻断肿瘤内淋巴管生成,抑制肿瘤的淋巴管转移,产生显著的抗肿瘤治疗效果。首先,从健康人外周血淋巴细胞中抽取mRNA,通过RT-PCR获得VEGFR1的信号肽和Ig1-3区基因,全基因合成VEGFR3信号肽和Ig1-3区基因。然后通过overlapPCR的方法将VEGFR1或VEGFR3的Ig1-3区基因分别与Fc段连接,构建VEGFR1Fc或VEGFR3Fc融合基因;通过overlap PCR的方法将VEGFR3的Ig1-2区基因,VEGFR1的Ig2-3区基因和Fc段基因依次连接,构建VEGFRFc融合基因;通过酶切连接的方法将VEGFR3的Ig1-2区基因与人抗体γ链恒定区基因连接,构建VEGFRIg-H融合基因;通过酶切连接的方法将VEGFR1的Ig2-3区基因与人抗体κ链恒定区基因连接,构建VEGFRIg-L融合基因。将上述各融合基因个分别装入真核表达质粒pDR1,构建出各VEGF受体融和蛋白表达质粒pDR（VEGFR1Fc）、pDR（VEGFR3Fc）、pDR（VEGFRFc）、pDR（VEGFRIg-H）、pDR（VEGFRIg-L）。分别将pDR（VEGFR1Fc）、pDR（VEGFR3Fc）或pDR（VEGFRFc）转染CHO细胞,并将pDR（VEGFRIg-L）和pDR（VEGFRIg-H）共转染CHO细胞,dotblot检测正确表达后,挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达,收集培养上清以rProteinA凝胶层析柱纯化,SDS-PAGE检测蛋白,鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符,纯度可达95%。采用ELISIA、竞争性封闭试验和表面等离子共振技术检测各VEGF受体融合蛋白的亲和力。用人脐静脉内皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测融合蛋白对VEGF-A/VEGF-C阻断作用。实验结果表明受体融合蛋白VEGFRIg与VEGF-A的亲和力和VEGFR1Fc相当,与VEGF-C的亲和力和VEGFR3Fc相当,并可有效地抑制VEGF-A和VEGF-C引起的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复。通过鸡胚尿囊膜（CAM）试验发现VEGFRIg可以有效地抑制鸡胚尿囊膜血管的生成,与VEGFR3Fc及无关抗体组相比具有明显增强的抑制血管生成的作用。体内血液动力学检测表明在C57/BL6小鼠的体内VEGFRIg融和蛋白的半衰期较VEGFR1Fc和VEGFR3Fc融和蛋白明显增长。右胁侧接种LM3肿瘤细胞的裸鼠用VEGF受体融合蛋白进行治疗,实验结果表明VEGFRIg具有比VEGFR1Fc、VEGFR3Fc明显增强的抗肿瘤作用,并能有效抑制肿瘤的淋巴转移。从上述体内外实验可以发现,VEGFRIg的体外生物学功能和联合应用VEGFR1Fc与VEGFR3Fc相当。但在体内实验中,由于VEGFRIg的血浆半衰期显著高于VEGFR1Fc与VEGFR3Fc,能够有效的抑制肿瘤血管和淋巴管的生长,所以其抑制肿瘤生长和转移的功能也明显增强。为了进一步改善VEGFRIg的药代动力学特性,增强其抗肿瘤疗效,通过与血浆半衰期较长的VEGFR2、VEGFR3的序列进行比对,我们选择VEGFR1上的几个的碱性氨基酸进行突变,构建VEGFRIgM受体融合蛋白。以pDR（VEGFRIg-L）为模板,设计点突变引物,以overlap-PCR方法构建VEGFR1与抗体轻链恒定区融合蛋白的突变体质粒pDR（VEGFRIg-LM）,并与pDR（VEGFRIg-H）共同转染CHO细胞,挑选出高表达的克隆大量表达,培养上清以rProteinA凝胶层析柱纯化,SDS-PAGE检测蛋白,并用等电聚焦电泳检测各融合蛋白的等电点,证明VEGFRIgM的等电点较突变前有明显减低。通过前述类似的体内外实验比较VEGFRIgM与VEGFRIg受体融和蛋白的功能。实验结果表明,VEGFRIgM与VEGF-A、VEGF-C的亲合力和VEGFRIg相当,能够有效的阻断VEGF-A、VEGF-C引起的脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。而VEGFRIgM的血浆半衰期明显长于VEGFRIg,其体内抑制血管生产的作用明显增强。与VEGFRIg相比,VEGFRIgM具有更显著的抗肿瘤生长和转移的作用。综上所述,我们构建的VEGFRIgM受体融合蛋白保留了与VEGF-A和VEGF-C的高亲和力,体内半衰期长,能够有效地抑制VEGF-A和VEGF-C引起的血管和淋巴管的生成,减少肿瘤的血液供应,抑制肿瘤的生长,并且抑制肿瘤的血管和淋巴转移。另外,我们设计的双功能分子的结构可有效地保持两种分子的活性,并可能应用于构建其他的双功能融合蛋白,为高活性双功能融合蛋白的制备提供了一种新的途径。