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穿心莲内酯衍生物抗H2O2诱导的胰岛细胞RIN-mβ凋亡的蛋白组学研究

2020-12-09阅读(700)

穿心莲内酯衍生物抗H2O2诱导的胰岛细胞RIN-mβ凋亡的蛋白组学研究

论文摘要

目的：用蛋白组学的方法研究穿心莲内酯衍生物AL-1抗H202诱导的胰岛RIN-mp细胞损伤的作用分子机理。方法：以400μM的H2O2作用于胰岛RIN-mβ细胞4h建立细胞凋亡模型,采用四氮唑蓝还原法（MTT）测定细胞生长存活率；碘化丙啶（PI）染色流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡率；荧光显微镜观察细胞凋亡形态的变化。采用蛋白组高通量技术,提取加药组（AL-1）（浓度为0.1μM,处理时间1 h）和对照组（Control）（加相应浓度的DMSO,处理时间1 h）总蛋白,双向凝胶电泳（2-DE）分离蛋白质,银染,ImageMaster 2D Platinum软件分析2D图谱,获得差异表达蛋白,质谱鉴定差异蛋白。用生物信息学方法对差异蛋白进行功能分类。用Westernblot方法,验证了RHO GDP-Dissociation 1, EF-Tu,14-3-3ζ等差异蛋白的变化。分析AL-1对胰岛RIN-mβ细胞的信号转导通路的影响。应用蛋白组学分析鉴定了处理组（AL-1+ H2O2）（0.1μM AL-1预孵1h,400μM H2O2作用4 h）与对照组（H2O2）（400μM H2O2作用4 h）凋亡蛋白差异的变化。结果：1)穿心莲内酯衍生物AL-1提高了H202处理的胰岛RIN-mβ细胞的存活率。2)建立了单独AL-1作用前后RIN-mβ细胞系的双向凝胶电泳图谱,鉴定了Thioredoxin, Peroxiredoxin-1, Peroxiredoxin-5, Glutaredoxin-3,14-3-3ζ, DJ-1, Hsp90ab1, HnrnpA2/B1, EF-Tu等在内的72个差异蛋白分子。这些蛋白涉及到糖代谢、核酸代谢、蛋白质代谢和修饰、信号转导、细胞凋亡、细胞结构和运动、免疫和防御等细胞生理过程相关的蛋白变化。发现处理组（AL-1+H2O2）与对照组（H202）中促进凋亡蛋白Isoform 3 of Programmed cell death 6-interacting protein, Galectin-1, Nuclear mitotic apparatus protein 1等都发生下调,抑制凋亡的蛋白Prohibitin, Heat shock protein 9, Hspa5, Isoform 1 of 60kDa heat shock protein等都发生上调。3)基于蛋白质组学的结果,进一步分析了AL-1通过激活Akt和ERK信号转导通路,诱导抗氧化蛋白和抗凋亡蛋白的表达,从而阐明了AL-1抗H202诱导胰岛细胞损伤和凋亡的作用分子机理。结论：本实验分析了AL-1处理胰岛RIN-mβ细胞前后细胞内蛋白质表达水平的变化,初步解释AL-1保护胰岛RIN-mp细胞的作用分子机理。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 目录
  • 第一章 前言
  • 1.1 氧化应激的概述
  • 1.2 糖尿病氧化应激的产生
  • 1.3 氧化应激对糖尿病的影响
  • 1.4 抗氧化治疗的应用前景
  • 1.4.1 穿心莲内酷及其抗氧化作用
  • 1.4.2 硫辛酸及其生物学作用
  • 1.5 蛋白质组学及蛋白质组学技术
  • 1.5.1 蛋白组概述
  • 1.5.2 蛋白组学研究技术
  • 第二章 技术路线
  • 第三章 材料与方法
  • 3.1 主要材料
  • 3.1.1 细胞系
  • 3.1.2 穿心莲内酯衍生物AL-1
  • 3.2 主要试剂
  • 3.2.1 细胞培养
  • 3.2.2 双向电泳试剂
  • 3.2.3 质谱鉴定试剂
  • 3.2.4 Western-blot试剂
  • 3.2.5 其他试剂
  • 3.3 生物信息学软件
  • 3.4 主要仪器
  • 3.5 相关溶液的配制
  • 3.5.1 双向电泳试剂配制
  • 3.5.2 银染染色液（以下配制均为两块胶用量）
  • 3.5.3 蛋白质酶解及质谱溶液
  • 3.5.4 Western blot试剂配方
  • 3.6 实验方法
  • 3.6.1 细胞培养
  • 3.6.2 MTT实验
  • 3.6.3 荧光显微镜检测细胞凋亡
  • 3.6.4 流式细胞术检测细胞凋亡
  • 3.6.5 用药胰岛RIN-mβ细胞培养
  • 3.6.6 细胞总蛋白裂解和提取
  • 3.6.7 Bradford法测定蛋白浓度
  • 3.6.8 二维电泳
  • 3.6.9 图像扫描与分析
  • 3.6.10 差异表达蛋白质酶解
  • 3.6.11 质谱鉴定
  • 3.6.12 差异表达蛋白质的功能分类
  • 3.6.13 AL-1处理前后胰岛RIN-mβ细胞蛋白变化的Western Blot验证
  • 3.7 荧光酶标仪检测AL-1处理前后胰岛RIN-mβ细胞内活性氧（ROS）的变化
  • 3.8 Western blot检测AL-1对Akt,ERK信号通路的影响
  • 3.9 蛋白质的网络关系图
  • 2O2诱导的细胞凋亡作用'>3.10 AL-1抗H2O2诱导的细胞凋亡作用
  • 3.11 统计学处理
  • 第四章 结果
  • 4.1 MTT检测AL-1对细胞的保护作用
  • 2O2导致的凋亡核型变化'>4.2 AL-1减轻H2O2导致的凋亡核型变化
  • 2O2导致的胰岛RIN-mβ细胞凋亡'>4.3 细胞仪检测AL-1降低H2O2导致的胰岛RIN-mβ细胞凋亡
  • 2O2所致胰岛RIN-mβ细胞损伤抗氧化蛋白表达的影响'>4.4 AL-1对H2O2所致胰岛RIN-mβ细胞损伤抗氧化蛋白表达的影响
  • 4.5 Bradford法测蛋白浓度
  • 4.6 AL-1处理胰岛RIN-mβ细胞前后的2-DE结果
  • 4.7 差异蛋白质的质谱鉴定
  • 4.8 差异蛋白的功能分类
  • 4.9 Western blot验证2DE结果中的部分差异蛋白
  • 4.10 AL-1调节抗氧化蛋白实现抗凋亡的作用
  • 4.11 AL-1处理胰岛RIN-mβ细胞后ROS的变化
  • 4.12 活性氧ROS的来源
  • 4.13 Akt/PKB,ERK与鉴定的蛋白质的网络关系图
  • 4.15 AL-1激活AKT,ERK信号转导通路
  • 2O2诱导的细胞凋亡作用'>4.16 AL-1抗H2O2诱导的细胞凋亡作用
  • 第五章 讨论与结论
  • 2O2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡保护作用'>5.1 穿心莲内酯衍生物AL-1对H2O2诱导的胰岛RIN-mβ细胞凋亡保护作用
  • 5.2 药物AL-1处理后胰岛RIN-mβ细胞蛋白质组学的变化及意义
  • 5.2.1 Thioredoxin（Trx）,Peroxiredoxin（Prx）等抗氧化蛋白
  • 5.2.2 Gclm
  • 5.2.3 14-3-3
  • 5.2.4 RHO-GDI 1
  • 5.2.5 DJ-1
  • 2B1'>5.2.6 hnRNP A2B1
  • 5.2.7 HSP
  • 5.3 AL-1增强NAD（P）H氧化酶活性导致ROS升高,激活Akt,ERK细胞信号转导通路
  • 5.4 AL-1保护作用的机理
  • 第六章 总结
  • 参考文献
  • 附录
  • 在学期间发表文章
  • 致谢

    • 相关论文文献

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