发酵轮叶党参提取物诱导HepG-2细胞凋亡作用研究

论文摘要

目的肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,恶性程度高,发展迅速。由于我国人民油腻饮食和乙肝患者的增多,肝癌的患病率和病死率在逐年升高,因此肝癌作为人类因癌症死亡的主要杀手已经引起人们的高度重视。轮叶党参属于多年生漫生草本,多以其根入药,也是民间喜食的山野菜之一,属于药食兼用型植物。它含有多种营养素及皂苷类、黄酮类等植物化学成分。本实验通过体外培养人肝癌HepG-2细胞,探讨发酵轮叶党参正丁醇萃取物诱导HepG-2细胞凋亡作用及其作用机理,为开发新型的肝癌化学预防剂提供理论基础。方法①用活性酵母发酵轮叶党参,经乙醇提取、正丁醇萃取而获得发酵轮叶党参提取物（FCLE）;②体外培养HepG-2细胞,取1×104个的细胞,药物组分为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL,150μg/mL、200μg/mL,采用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用,并用SPSS17.0统计软件计算出药物的半数抑制浓度（IC50）;③体外培养HepG-2细胞,取1×104个的细胞,利用FCLE不同药物浓度,采用吖啶橙（AO）染色法,荧光显微镜下观察HepG-2细胞凋亡的形态学特征；④体外培养HepG-2细胞,取1×104个的细胞,利用FCLE不同药物浓度,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率；⑤体外培养HepG-2细胞,取1×104个细胞,根据FCLE不同药物浓度,利用Caspase活性检测试剂盒,分别检测Caspase-3、8、9的活性；⑥体外培养HepG-2细胞,取1×104个的细胞,根据FCLE不同药物浓度,利用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒,进行细胞周期与细胞凋亡的相关分析。结果①MTT实验结果显示,FCLE药物浓度越高,其对HepG-2细胞增殖的抑制作用越强,呈浓度依赖性,其IC50为239.623μg/mL;②AO染色法荧光显微镜下可见,正常细胞核染色质结构正常,胞膜完整,胞质呈红色荧光；凋亡细胞,核染黄绿色荧光,呈致密斑块或碎片状,可见包膜泡状膨突和凋亡小体；③流式细胞仪检测结果表明,随着药物浓度的升高,其凋亡率随之升高,并且100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组的凋亡率均显著高于空白对照组的凋亡率,（P<0.01）,不同药物浓度组间凋亡率比较,200μg/mL药物组的凋亡率均显著高于100μg/mL和150μg/mL药物组的凋亡率,150μg/mL药物组的凋亡率亦显著高于100μg/mL药物组的凋亡率（P＜0.01）；④aspase-3、8、9活性检测结果表明,100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组的Caspase-3的活性均显著高于空白对照组的Caspase-3活性（P＜0.01）,各药物浓度组间比较没有差异（P＞0.05）;100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组的Caspase-8的活性均显著高于空白对照组的Caspase-8活性（P＜0.01）,200μg/mL药物组的Caspase-8活性高于100μg/mL药物组的Caspase-8活性（P<0.05）,其他药物浓度组间比较没有差异（P＞0.05）;100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组Caspase-9的活性均显著高于空白对照组的Caspase-9活性（P＜0.01）,150μg/mL、200μg/mL药物组的Caspase-9活性亦显著高于100μg/mL药物组的Caspase-9活性（P＜0.01）,150μg/mL、200μg/mL之间比较没有差异性（P＞0.05）。⑤细胞周期检测结果表明,100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL药物组三种浓度均可将人肝癌细胞HepG-2周期阻滞在G0/G1期,G0/G1期细胞数的比例明显增多,而S期和G2/M期细胞比例明显减少,与空白对照组比较,100μg/mL、150μg/mL 200μg/mL药物组Go/G1期细胞所占比例明显高于空白对照组,而S期的细胞所占比例明显低于空白对照组（P＜0.01）。结论1.FCLE可抑制HepG-2细胞的增殖,并且随着药物浓度的升高,抑制作用增强；2.FCLE可促进HepG-2细胞凋亡,在本实验剂量范围内,药物浓度越高,其促凋亡作用越明显；3.FCLE可通过激活Caspase-8,再向下激活Caspase-9,进而激活下游的Caspase-3,最终诱导HepG-2细胞发生凋亡；4. FCLE可将HepG-2细胞阻滞在G0/Gl期,并呈浓度依赖性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 发酵轮叶党参正丁醇提取物的制备
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 样品的制备
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 试剂和细胞株
• 2.2.3 相关溶液的配制
• 2.2.4 试验用药物浓度配制
• 2.2.5 HepG-2细胞培养
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 发酵轮叶党参正丁醇提取物最佳溶剂筛选实验
• 2.3.2 测定发酵轮叶党参正丁醇提取物对HepG-2细胞的抑制作用
• 2.3.3 AO染色法荧光显微镜下观察
• 2.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2.3.5 Caspase-3活性检测
• 2.3.6 Caspase-8活性检测
• 2.3.7 Caspase-9活性检测
• 2.3.8 细胞周期的检测
• 2.4 统计学处理
• 第三章 实验结果
• 3.1 FCLE不同溶剂对MTT试验结果的影响
• 3.2 FCLE对HepG-2细胞增殖的抑制作用
• 3.3 FCLE诱导HepG-2凋亡的作用
• 3.3.1 AO染色法荧光显微镜下观察
• 3.3.2 流式细胞仪测定细胞凋亡率的结果
• 3.4 Caspase-3,8,9活性检测结果
• 3.4.1 Caspase-3,8,9的标准曲线
• 3.4.2 Caspase活性检测结果
• 3.4.2.1 Caspase-3活性检测结果
• 3.4.2.2 Caspase-8活性检测结果
• 3.4.2.3 Caspase-9活性检测结果
• 3.5 FCLE对HepG-2细胞周期的影响
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 第五章 结论
• 致谢
• 综述
• 参考文献