家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性研究及其基因克隆

论文摘要

家蚕的胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymotrypsin inhibitor,CI）在维持家蚕的正常生长发育中具有重要作用。迄今为止,人们已经对其遗传规律、在染色体上的定位、分离纯化、蛋白的基本理化性质、基因组序列和结构、表达谱、表达调控和生理功能等方面进行了较为详细的研究。在此基础上,本文首先调查分析了家蚕CI在品系间的多态性分布;其次利用已知的CI基因信息,克隆并分析了一个新的家蚕CI基因;然后,结合家蚕全基因组序列信息对家蚕CI基因群进行了综合分析。 本研究利用非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-polyacrylamide gel electrophoresis,Native-PAGE）电泳对425个家蚕品种的血液CI分布进行了调查,,结果表明:（1）编码CI的3个基因Ict-E、Ict-D和Ict-A在所有品系中均表达,表明它们对家蚕的正常生长发育是必要的;9个品系没有基因Ict-H和Ict-B的表达,这些品系生长发育相对缓慢,但并没有重大的生理缺陷;（2）家蚕中系和日系之间,CI分布情况基本一致;（3）发现以前报道很少的CI-5、CI-11和CI-12在此次调查的多个品系中表达,并且CI-5通常和CI-6’一起表达,CI-11、CI-12通常和CI-13’一起表达,基于CI-11、CI-12、CI-13’和CI-13a、CI-13b、CI-13c在带形和表达上的一致性,推测CI-11应为CI-13’a,CI-12为CI-13’b;（4）使用软件DPS将52个纯品系的电泳结果进行聚类分析,发现聚类结果与其系统、眠性和化性没有明显的相关性。各种CI广泛存在于不同家蚕品系中,可能与家蚕基本的生理生化相关。 根据家蚕SCI-SB的mRNA设计引物,从家蚕品系13-121的基因组DNA和cDNA中克隆了一个新的CI基因。对其基因结构进行分析,发现克隆的基因组序列共含有3个外显子和2个内含子,外显子和内含子边界符合典型的GT-AG结构,而且内含子中没有插入反转座子Bm1。其基因组结构与CI-b1和CI-13的是相似的。克隆的CI基因开放阅读框长度为255 bp,编码85个氨基酸,前23个氨基酸残基为信号肽。预测成熟蛋白质的分子量为7059.81Da,等电点为4.49。使用SMART在线程序预测蛋白质结构域,显示该蛋白含有一个典型的Kunitz结构域。与家蚕其他同类型的CI相比,具有5个CI保守的半胱氨酸残基,活性位点为AYI,与基因Ict-A编码的CIs的活性位点相同。在Genebank进行同源性检索,结果显示所克隆的基因与家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂同源。因此此次克隆的基因为一个新的Kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。RT-PCR分析发现CI-fb在家蚕13-121的脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、气管和中肠6个组织中表达,而在丝腺、血细胞和体壁中没有表达,是一个组织特异性表达的基因。其他的Kunitz类型的CI也是组织特异表达的。 在Genebank进行同源性检索还发现:在核酸序列水平上,CI-fb与家蚕Kunitz类型的CI-13、CI-b1和SCI-SB同源性分别是94%、95%和94%;在氨基酸序列水平,与CI-13、CI-1、CI-2、CI-b1和SCI-SB同源性分别是83%、85%、85%、84%和90%。该结果表明CI-fb与Kunitz类型CI不论在核酸或蛋白水平都显示出高度的同源性,暗示它们可能来源

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1.1 胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究进展
• 1.1.1 胰凝乳蛋白酶的研究
• 1.1.2 胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究
• 1.1.3 植物中的胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究
• 1.1.4 动物中的胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究
• 1.1.5 各种蛋白酶抑制剂在害虫防治中的研究与应用
• 1.2 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究进展
• 1.2.1 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的遗传研究
• 1.2.2 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的分类及理化性质
• 1.2.3 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的基因组结构的研究
• 1.2.4 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的时空表达研究
• 1.2.5 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的功能研究
• 1.2.6 家蚕茧丝胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究
• 1.3 问题与展望
• 第二章 引言
• 2.1 研究背景和意义
• 2.2 技术路线
• 第三章 家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料和主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 CI多态性分布的总体特征
• 3.2.2 中系与日系CI分布的比较
• 3.2.3 CI-13的多态性分布
• 3.2.4 CI-5、CI-11和CI-12的分布特点
• 3.2.5 聚类结果
• 3.3 讨论
• 第四章 家蚕一个新的Kunitz CI基因的克隆和分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 载体及宿主菌
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法和步骤
• 4.2.1 基因组序列的扩增和克隆
• 4.2.2 cDNA的克隆和序列分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 家蚕CI基因的基因组序列克隆
• 4.3.2 家蚕CI基因的cDNA序列克隆
• 4.3.3 克隆的CI基因序列分析
• 4.3.4 克隆的CI基因在组织和器官的表达模式
• 4.4 讨论
• 第五章 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的序列分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 Genbank的家蚕CI序列
• 5.2.2 基因组序列的检索和分析
• 5.2.3 EST序列的检索和分析
• 5.3 讨论
• 第六章 小结
• 参考文献
• 附录：发表论文及参与课题
• 致谢