海蜇降压肽提取工艺研究与效果测定

论文摘要

本文首先对不同种类和处理的海蜇分部进行成分和氨基酸测定,海蜇和沙蜇成分相差不大,面蜇和黄斑海蜇的蛋白质含量要低于海蜇;海蜇伞部的总氨基酸含量最多,为127.32 mg/g干重,必需氨基酸含量也达到29.31%。对两种现有降压肽体外测定方法（紫外分光光度法和可见分光光度法）进行了对比研究,前法由于萃取过程中不可控因素较多,精密度太差而致使测定误差较大,且操作麻烦,不宜用于降压肽的测定;可见分光光度法不需从反应体系中提取马尿酸,操作相对简单,灵敏度高、数据稳定,重复性也较好,但当用猪肺粗提ACE酶液时数据不稳定,只有用较纯的ACE酶才能得到比较稳定的测定结果。探索了薄层层析-分光光度法测定降压肽的体外ACE抑制效果的条件,精密度试验的变异系数为2.17%（n =8）,此法测定降压肽,重复性好,数据稳定,但操作复杂,步骤繁琐,人为因素影响较大。建立的薄层色谱扫描法,测定简便,准确度高,线性回归方程为:y=20431.098+713.059x ,相关系数r=0.99185。测定精密度的变异系数为0.04%。利用酶解法制备海蜇降压肽,并对工艺参数做了一些探讨。发现腌渍海蜇皮冲洗、匀浆、杀菌后,按50ku/100gPr的添加量加入中性蛋白酶,在45℃水浴中酶解9h,粗滤后通过5kDa的超滤膜时,ACE抑制率最大。100℃浓缩对其影响不大,冷冻会使其ACE抑制率明显降低。体内实验研究了海蜇降压肽对肾动脉狭窄和L-NNA药物致高血压两种高血压模型血压的影响,结果表明:在灌胃剂量小于60mg/Kg.bw剂量范围内,降血压肽的剂量与两种模型的收缩压降压效果均成一定的正相关性。灌胃剂量超过60mg/Kg.bw时,血压下降值都基本趋于平缓。海蜇降血压肽对正常兔子血压无影响。海蜇降压肽五个不同样品的体内和体外测定对比,测定结果基本一致,冰冻使样品降压效果明显减小,而灭菌和浓缩对降压效果影响不大。体外模拟消化作用对海蜇降压肽降压效果影响不大,说明降压肽具有抗消化的能力。脱苦、缓释处理后的体内体外对比发现,先加入0.5%粉末活性炭,55℃下吸附20min,再加入1.5%β-环糊精,于65℃下包埋30min的处理最好,不仅能脱出苦味,而且大大延长了药效,起到了缓释的作用。将海蜇降压肽与四种化学合成药物相比较。体外试验显示:北京降压0号抑制率最低,贝那普利抑制率最高达到64.9%,海蜇降压肽次之,而缬沙坦和伲福达没有抑制效果。体内试验:在灌胃剂量正常条件下,钙离子拮抗剂伲福达不能对肾动脉狭窄高血压模型起到降压效果;海蜇降压肽比缬沙坦降血压肽作用时间较快,维持时间较短,但如果加大剂量也会达到与缬沙坦维持时间相同的效果;与盐酸贝那普利相比,贝纳普利降压幅度较大些,但加大剂量会引起低血压,这样大的落差对高血压病人是极为不利的。而降血压肽不会出现这种情况。进行海蜇降压肽的放大试验,并对样品做了体内体外测定。在体内测定中,D9和E10均能使高血压降至正常值,且维持时间在20个小时。体外测定D9和E10的抑制率分别为67.3%和61.5%,其它样品则抑制率较小。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语（Abbreviation）
• 第一章 引言
• 1.1 高血压及血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）
• 1.1.1 高血压的危害及现状
• 1.1.2 高血压的分类与成因
• 1.1.3 血管紧张素转化酶与高血压
• 1.1.3.1 血管紧张素转化酶
• 1.1.3.2 ACE 对血压的调节作用
• 1.1.4 ACEI 的研究进展
• 1.2 食物蛋白源降压肽的研究现状
• 1.2.1 降压肽与ACE 抑制剂的区别
• 1.2.2 食物蛋白源降压肽的降压机理
• 1.2.3 食物蛋白源降压肽的来源及种类
• 1.2.4 食物蛋白源降压肽的制备研究
• 1.2.4.1 制备方法的研究进展
• 1.2.4.2 多肽脱苦的研究
• 1.2.5 食物蛋白源降压肽的利弊分析
• 1.3 降压肽活性测定方法的研究进展
• 1.3.1 体外活性测定方法
• 1.3.1.1 紫外分光光度法
• 1.3.1.2 可见分光光度法
• 1.3.1.3 酶偶联法
• 1.3.1.4 高效液相色谱法
• 1.3.1.5 高效毛细管电泳
• 1.3.2 体内活性测定的高血压模型
• 1.3.2.1 肾血管性高血压模型
• 1.3.2.2 自发性高血压大鼠模型
• 1.3.2.3 药物诱导性高血压大鼠模型
• 1.4 海蜇概况
• 1.4.1 海蜇资源利用状况
• 1.4.1.1 海蜇的外貌与习性
• 1.4.1.2 我国的海蜇种类及分布
• 1.4.2 海蜇的研究进展
• 1.4.2.1 食用研究进展
• 1.4.2.2 药用研究进展
• 1.4.2.3 海蜇成分测定的研究进展
• 1.5 本课题的研究目的与意义
• 第二章 海蜇成分测定与氨基酸分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品的前处理
• 2.2.2 蛋白含量测定
• 2.2.3 水分的测定
• 2.2.4 灰分的测定
• 2.2.5 脂肪测定
• 2.2.6 糖类测定
• 2.2.7 氨基酸测定
• 2.2.8 必需氨基酸指数
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 海蜇的主要成分测定
• 2.3.2 腌制海蜇的无机成分分析
• 2.3.3 四种海蜇的氨基酸组成及含量分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 现有ACEI体外抑制活性测定方法的对比研究
• 3.1 紫外分光光度测定方法及探索
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.1.1 材料与试剂
• 3.1.1.2 主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 药品的配制
• 3.1.2.2 测定方法
• 3.1.3 结果与分析
• 3.1.3.1 底物的用量对结果的影响
• 3.1.3.2 乙酸乙酯萃取次数对结果的影响
• 3.1.3.3 乙酸乙酯的烘干时间和温度对结果的影响
• 3.1.3.4 紫外分光光度法精密度实验
• 3.1.4 小结
• 3.2 可见分光光度测定方法及探索
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.1.1 材料与试剂
• 3.2.1.1 实验仪器与设备
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 马尿酸标准曲线建立
• 3.2.2.2 测定方法
• 3.2.2.3 ACE 的抑制率的计算方法
• 3.2.3 结果与分析
• 3.2.3.1 喹啉与BSC'最佳比例的选择
• 3.2.3.2 温度对反应体系的影响
• 3.2.3.3 混匀方式对测定的影响
• 3.2.3.4 ACE 酶液的影响及稳定性研究
• 3.2.3.5 可见分光光度法测定的精密度试验
• 3.2.4 小结
• 3.3 本章小结
• 第四章 降压肽体外活性新测定方法的建立研究
• 4.1 薄层层析-分光光度法的建立
• 4.1.1 实验材料和方法
• 4.1.1.1 实验材料
• 4.1.1.2 实验仪器与设备
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 展开剂的配制
• 4.1.2.2 显色剂的配制
• 4.1.2.3 实验步骤
• 4.1.2.4 标准曲线的建立
• 4.1.2.5 ACE 抑制率的计算
• 4.1.3 结果与分析
• 4.1.3.1 展开剂最佳配比的选择
• 4.1.3.2 显色剂储存时间对结果的影响
• 4.1.3.3 补充显色剂配比
• 4.1.3.4 补充显色后水浴温度与时间的关系
• 4.1.3.5 马尿酸标准曲线的建立
• 4.1.3.6 薄层层析-分光光度法的精密度试验
• 4.1.4 小结
• 4.2 薄层色谱扫描法的建立
• 4.2.1 材料与仪器
• 4.2.1.1 材料与试剂
• 4.2.1.2 主要仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 展开剂的配制
• 4.2.2.2 半自动点样仪的操作及设定
• 4.2.2.3 薄层扫描仪的参数设定
• 4.2.2.4 光谱扫描
• 4.2.2.5 标准曲线的建立
• 4.2.2.6 样品的测定
• 4.2.2.7 抑制率的计算
• 4.2.3 结果与讨论
• 4.2.3.1 盐酸浓度及用量对点样液的影响
• 4.2.3.2 冷冻时间对点样液的影响
• 4.2.3.3 光谱扫描确定最大吸收波长
• 4.2.3.4 标准曲线的建立
• 4.2.3.5 样品测定加样回收率试验
• 4.2.3.6 稳定性和精密度试验
• 4.2.4 小结
• 4.3 本章小结
• 第五章 海蜇降压肽制备工艺的研究
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 原料与试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 测定方法
• 5.2.2 抑制率的计算
• 5.2.3 工艺流程
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 海蜇种类和部位对降压效果的影响
• 5.3.2 海蜇前处理中灭菌对结果的影响
• 5.3.3 酶解过程中酶的种类对抑制率的影响
• 5.3.4 酶解过程中的双因素探索
• 5.3.4.1 酶解温度与时间
• 5.3.4.2 酶用量与时间对抑制率的影响
• 5.3.5 酶的用量、酶解温度、时间的正交试验设计
• 5.3.6 超滤膜的选择
• 5.3.7 冷冻温度与时间对抑制率的影响
• 5.3.8 浓缩温度与时间对抑制率的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章 海蜇降压肽体内降压活性的研究
• 6.1 材料与仪器
• 6.1.1 实验动物与原料
• 6.1.2 试剂
• 6.1.3 仪器及用具
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 试验用兔子饲喂方法
• 6.2.2 实验兔子血压测定方法
• 6.2.3 肾动脉狭窄型高血压模型的建立方法
• 6.2.4 L-NNA 致高血压模型的建立
• 6.2.5 实验动物分组方法
• 6.2.6 海蜇降压肽液体样品与冻干品溶液的制备方法
• 6.2.7 数据记录观察方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 高血压兔子模型
• 6.3.2 剂量与降压幅度的量效关系
• 6.3.3 降压肽对两种高血压模型的降压效果
• 6.3.4 降压肽剂型对降压效果的影响比较
• 6.3.5 降血压肽剂量与降压幅度、压降时间的关系
• 6.3.6 降压肽对正常兔子血压的影响
• 6.4 本章小结
• 第七章 海蜇降压肽体内降压活性与体外抑制作用的相关性比较研究
• 7.1 材料与仪器
• 7.1.1 材料与试剂
• 7.1.2 仪器
• 7.2 方法
• 7.2.1 体内测定
• 7.2.2 体外测定
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 不同样品体内体外测定对比
• 7.3.1.1 体内降压活性随时间的变化
• 7.3.1.2 体外ACE 抑制率的测定
• 7.3.2 同一样品不同处理的体内体外测定
• 7.3.2.1 体内降压效果测定
• 7.3.2.2 体外ACE 抑制率随时间的变化
• 7.4 本章小结
• 第八章 模拟体内消化处理和脱苦、缓释处理对海蜇降压肽活性影响的研究
• 8.1 材料、试剂与仪器
• 8.1.1 材料与试剂
• 8.1.2 仪器
• 8.2 方法
• 8.2.1 人工胃液的配制
• 8.2.2 人工肠液的配制
• 8.2.3 消化降压肽的制备
• 8.2.4 体外测定
• 8.2.5 体内测定
• 8.3 结果与分析
• 8.3.1 模拟体内消化处理后降压肽的体内测定
• 8.3.2 模拟体内消化处理后降压肽的体外ACE 抑制率
• 8.3.3 脱苦与缓释处理方法的选择
• 8.3.3.1 脱苦与缓释后降压肽的体外ACE 抑制率测定
• 8.3.3.2 脱苦与缓释后降压肽的体内降压活性测定
• 8.4 本章小结
• 第九章 海蜇降压肽与药物降压效果的对比研究
• 9.1 试剂与仪器
• 9.1.1 试剂与材料
• 9.1.2 仪器
• 9.2 测定方法
• 9.3 结果与分析
• 9.3.1 降压肽与药物的体外对比测定
• 9.3.2 降压肽与三类代表性药物各自的体内量效关系变化比较
• 9.3.2.1 降压肽与钙离子拮抗剂类降压药伲福达的降压效果对比
• 9.3.2.2 降压肽与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂类降压药缬沙坦的降压效果对比
• 9.3.2.3 降压肽与ACE 抑制剂类降压药贝那普利的降压效果对比
• 9.4 本章小结
• 第十章 海蜇降压肽制备工艺的放大试验
• 10.1 材料与方法
• 10.1.1 材料与试剂
• 10.1.2 主要设备
• 10.2 方法
• 10.2.1 放大试验生产车间图
• 10.2.2 放大试验工艺流程
• 10.2.3 试验设备图
• 10.2.4 体外测定
• 10.2.5 体内测定
• 10.3 结果与讨论
• 10.3.1 感官鉴评
• 10.3.2 试样品的体外 ACE 抑制作用测定
• 10.3.3 中试样品的体内降压活性测定
• 10.3.4 中试样品的体内降压活性测定
• 10.4 小结与建议
• 总结
• 论文的创新点
• 参考文献
• 致谢