帕金森病相关蛋白-Nurr1对酪氨酸羟化酶及p53转录活性的调控

论文摘要

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病,它是继阿尔海默兹病的世界上第二常见的神经退行性疾病,大约影响了60岁以上人口的百分之一。帕金森病表现为静止性振颤,僵直,运动徐缓等临床特征。PD主要的病理特征是中脑多巴胺能神经元的丧失和路易小体的形成。但是,PD的确切病因却仍然不清楚。目前已发现多种基因与PD的发生直接相关,其中一种就是Nurr1。Nurr1是孤核受体家族成员之一,人们至今没有发现这类家族成员相应的配体。Nurr1在多巴胺能神经元的发育和存活过程中起着十分重要的作用。Nurr1序列的突变-291Tdel和-254T→G已在家族性PD病人中发现,并且这两种突变体降低了酪氨酸羟化酶（TH）的表达,这说明Nurr1与PD的发生直接相关。Nurr1作为转录因子,蛋白质的翻译后修饰是它改变其转录活性的重要手段之一。最近,有文献报道了Nurr1有抗凋亡功能,但具体机制不明。本论文主要探讨了Nurr1被ERK2磷酸化,并且磷酸化的Nurr1的转录活性有所提高,导致TH的表达量升高;Nurr1通过与p53的结合,影响p53的转录活性,表现出促细胞存活的能力。主要研究结果如下:1.我们运用了体外结合实验和免疫共沉淀方法,发现Nurr1与ERK2在体外和细胞内（二者蛋白共转染）的情况下,这两个蛋白可以结合。并且通过体外磷酸化的实验证明了Nurr1能够被活化的ERK2磷酸化。我们制备了Nurr1的不同潜在ERK2结合结构域的缺失突变体,通过进一步的体外结合实验,阐述了Nurr1序列当中与ERK2的结合位点。而且通过将Nurr1序列当中的一共6个预测的ERK2的磷酸化位点的缺失或者点突变,进行体外磷酸化的实验,证实了Nurr1序列当中的S126和T132为主要的磷酸化位点,T129和T185为次要的磷酸化位点。我们进一步探讨了被ERK2磷酸化的Nurr1的转录活性是否发生变化,我们通过报告基因的实验,验证了被ERK2磷酸化的Nurr1提高了Nurr1下游的TH的表达量,并且将Nurr1序列当中的ERK2磷酸化位点突变后,对TH的提高效应就消失了。这些结果提示,Nurr1能够被ERK2磷酸化,并且被ERK2磷酸化后的Nurr1的转录活性提高了。2.我们通过过度表达Nurr1在不同的真核细胞中,发现Nurr1能够降低促凋亡基因Bax的表达,并且通过RNA干扰的手段将消减Nurr1在这些细胞中的表达,检测到Bax的表达水平上升。由于Bax的表达量的降低会导致细胞存活,故而采取了MTT的方法来验证了过度表达Nurr1确实能够提高细胞存活率,并且在诱导凋亡药物-阿霉素的刺激下,Nurr1仍然有着促细胞存活的功能。由于Bax是p53的靶基因,因而我们用体外结合实验和免疫共沉淀的实验来验证了Nurr1与p53之间的结合,我们又通过报告基因实验验证了Nurr1能够抑制p53的转录活性,导致了p53的下游靶基因的表达降低。我们运用p53和Nurr1不同缺失突变体进行了体外结合实验,找出了Nurr1的DBD和p53结合,p53的羧基端与Nurr1结合。接下来,我们进一步探讨了Nurr1是如何影响p53的转录的。通过报告基因实验,我们发现Nurr1对p53的转录影响是依赖于这两个蛋白的相互结合的;并且通过体外竞争结合实验,发现Nurr1与p53的结合影响了p53的低聚物的形成,最终导致了p53的转录活性的降低。通过以上结果,我们阐述了Nurr1被ERK2的磷酸化修饰,提高TH的表达,以及Nurr1通过抑制p53的转录活性来实现的其保护功能,这一发现可能为我们更好地了解帕金森病的发病机制,寻求治疗帕金森病的方法以及对于攻克癌症发生的难关提供一些帮助。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 绪论
• 1.1 Nurr1与帕金森病
• 1.1.1 Nurr1的发现与研究进展
• 1.1.2 Nurr1与帕金森病
• 1.2 Nurr1的功能与蛋白质的翻译后修饰
• 1.2.1 ERK2（Extracellular signal-regulated protein kinases 2,胞外信号调节蛋白激酶2）
• 1.2.2 ERK2与神经退行性疾病
• 1.3 Nurr1,p53与细胞凋亡
• 1.3.1 Nurr1和NGFI-B家族成员的促进凋亡或者存活的细胞功能
• 1.3.2 p53与细胞凋亡
• 第二章 材料与方法
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 ERK2磷酸化Nurr1,并且提高Nurr1对TH的转录活性
• 3.1.1 Nurr1与ERK2结合并被ERK2磷酸化
• 3.1.2 确定Nurr1序列当中的与ERK2的结合位点
• 3.1.3 确定Nurr1序列当中的ERK2的磷酸化位点
• 3.1.4 被ERK2磷酸化的Nurr1提高TH的表达
• 3.1.5 讨论
• 3.2 Nurr1与p53结合和调节p53的转录活性
• 3.2.1 Nurr1降低Bax的表达水平,并且保护细胞免受Dox诱导的调亡
• 3.2.2 Nurr1在体外和体内的情况下与p53结合
• 3.2.3 Nurr1能够抑制p53的转录活性
• 3.2.4 Nurr1抑制p53的自身结合,并且对p53的抑制是依赖于与Nurr1的结合和依赖于Nurr1的量
• 3.2.5 讨论
• 3.3 总结与展望
• 3.3.1 总结
• 3.3.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议