红皮梨色泽变异系的分子标记鉴定及遗传差异分析

论文摘要

果皮的色泽是果实外观品质的核心内容,也是影响其商品价值的重要指标。在我国的水果消费市场上,色泽鲜艳的水果总是更加受到消费者的青睐。近年来,优质红皮梨品种的栽培成为一个新发展热点,培育红色果皮的梨新品种也成为梨种质创新的一项重要研究内容。相对于苹果、柑橘、葡萄等水果,有关梨果皮色泽形成的研究报道较少,研究进展相对滞后。因此,本研究以几组红色及其绿色变异系梨品种为研究试材,开展了分子标记鉴定以及遗传表达分析,以期从分子水平上揭示形成色泽差异的原因,从而为探明梨红色果皮形成的分子机制奠定基础。具体研究结果如下：一、利用AFLP和SRAP标记对3组梨果皮色泽变异品种（系）进行鉴别。54对AFLP引物共检测1089个位点,其中多态性条带数为688,多态性比率为63.2%；20对SRPA引物可检测210个位点,其中多态性条带为76条,多态性比率为36.2%。分析结果表明,7对AFLP引物、3对SRAP引物可区分南果与其红色变异系；3对AFLP引物、1对SRPA引物可区分考密斯、红考密斯、早红考密斯与其绿色变异系；所检测的引物均无法区分红安久及其绿色变异系。综合AFLP与SRAP标记的检测结果,获得4个品种（系）的特征谱带,SRPA引物em11/me5可区分除红安久及其变异系以外的所有供试材料,可应用于各品种（系）的分子鉴别。二、以早红考密斯及其绿色变异系为试材,研究果实不同发育期果皮中花青素含量的动态变化及含量差异。结果表明,早红考密斯及其绿色变异系的花青素发育动态变化均呈现先上升后下降再上升的趋势,早红考密斯在花后40天,花青素含量达到最大值,为298mg/g;早红考密斯绿色变异系在花后55天花青素含量达到最大值,为35.4mg/g.在整个发育期内,早红考密斯的花青素含量均高于绿色变异系；与早红考密斯果实相比,绿色变异系在花后70天时花青素含量相差最大,此时,红色果皮花青素含量是绿色变异系的9.90倍。由此得出：早红考密斯的花青素含量显著高于绿色诱变系,花青素的含量水平差异是影响其形成色泽差异的重要因素。三、以早红考密斯及其绿色变异系为试材,利用cDNA-AFLP技术进行差异表达分析。分别提取两个供试材料花后40天的果皮RNA,反转录为cDNA,并采用64对AFLP引物组合进行表达分析。其中60对AFLP引物组合能扩增出稳定、清晰的条带,共得到稳定差异位点数47个。将47条差异条带进行回收、克隆、测序,得到EST序列并进行BLAST比对,分析结果表明20条片段为已知功能基因序列,20条为功能未知基因序列,7条比对无结果；对已知功能的20个EST序列进一步进行功能分类分析,包括信号转导基因1个,标记基因4个,转录因子2个,抗病防卫基因11个,初级代谢调控蛋白1个,参与花青素合成相关的基因1个。本研究中将克隆的参与花青素合成的表达序列命名为PyMADS18,其与MADS-box转录因子高度同源。四、以不同发育期的早红考密斯及其绿色变异系果皮为研究试材,对PyMADS18差异基因（与MADS-box高度同源）进行实时荧光定量PCR分析。早红考密斯果实整个发育期,果皮中PyMADS18基因表达量动态变化为先下降后上升,花后40天表达量最大（1.00）,这与花青素含量变化动态相一致；在早红考密斯绿色变异系果实整个发育期,果皮中PyMADS18基因表达量动态变为先上升后下降再上升,花后55天表达量最高（0.53）,其变化动态与花青素含量动态变化也相符合。以上结果表明,花青素PyMADS18基因的表达与花青素含量呈正相关,参与花青素的合成,影响花青素的积累。同一时期红色果皮与绿色变异系的比较表明,花后40天PyMADS18基因在红色果皮中高量表达,而绿色品种表达量低,且表达差异显著,这与两者在坐果初期即表现明显的色泽差异是相关的。但是其后的各发育期,PyMADS18基因在绿色果皮中的表达量都高于红色品种,推测PyMADS18参与了果实发育早期花色素合成的调控。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 红皮梨种质资源
• 1.1 西洋梨
• 1.1.1 早红考密斯
• 1.1.2 红安久
• 1.1.3 考密斯
• 1.2 东方梨
• 1.2.1 红香酥
• 1.2.2 满天红
• 1.2.3 八月红
• 1.2.4 南果
• 2 红皮梨的发展前景
• 2.1 红皮梨遗传规律研究
• 2.2 皮梨资源与育种
• 3 梨果皮色泽的研究
• 3.1 花青素合成途径的关键酶
• 3.1.1 查耳酮合酶（CHS）
• 3.1.2 苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶（CHI）
• 3.1.3 黄烷酮-3-羟化酶（F3H）
• 3.1.4 F3’H和F3’5’H
• 3.1.5 二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）
• 3.1.6 花色素合成酶（ANS）
• 3.1.7 UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）
• 3.2 花青素合成的调控因子
• 3.2.1 MYB蛋白
• 3.2.2 bHLH蛋白
• 3.2.3 WD40蛋白
• 3.2.4 MADS-box
• 3.3 影响花青素合成的其它因素
• 3.3.1 糖对花青素合成的影响
• 3.3.2 植物激素对花青素合成的影响
• 3.3.3 光对花青素合成的影响
• 3.4 花青素的研究展望
• 4 果树突变体的产生及鉴定
• 4.1 自然芽变
• 4.2 芽变的鉴定方法
• 4.2.1 染色体观察法
• 4.2.2 同工酶分析法
• 4.2.3 孢粉学研究法
• 4.2.4 分子生物技术
• 4.3 人工诱变
• 4.3.1 辐射诱变国内外进展
• 4.3.2 辐射诱变材料
• 4.3.3 辐射诱变剂
• 4.3.4 辐射效应
• 5 果树研究中常用的分子标记技术
• 5.1 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 5.2 随机扩增多态性DNA（RAPD）
• 5.3 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 5.4 相关序列扩增多态性（SRAP）
• 5.5 简单重复序列（SSR）
• 6 cDNA-AFLP技术及其应用
• 6.1 cDNA-AFLP技术原理
• 6.2 cDNA-AFLP技术流程
• 6.3 cDNA-AFLP技术特点
• 6.3.1 可以反映基因间表达量的差异
• 6.3.2 重复性高,假阳性低
• 6.3.3 全面获取转录组的表达信息
• 6.4 cDNA-AFLP技术应用
• 第二章 梨果皮色泽变异品种（系）的分子标记鉴定
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 基因组DNA的提取
• 1.2.2 AFLP标记分析
• 1.2.3 SRAP标记分析
• 1.3 数据统计与处理
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组DNA扩增结果
• 2.2 AFLP标记鉴定色泽变异品种（系）
• 2.3 SRAP标记鉴定色泽变异品种（系）
• 2.4 不同品种（系）的指纹图谱及系谱关系
• 3 讨论
• 3.1 分子标记在果树突变系鉴定中的应用
• 3.2 不同分子标记的鉴别效率
• 4 小结
• 第三章 早红考密斯及其绿色变异系果皮中花青素含量的比较研究
• 摘要
• 前言
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果分析
• 2.1 早红考密斯及其绿色变异系果皮中花青素含量的变化
• 2.2 早红考密斯及其变异系果皮花青素含量的比较
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 早红考密斯及其绿色变异系CDNA-AFLP的表达差异分析
• 摘要
• 前言
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 RNA提取
• 1.2.2 第一链cDNA反应合成
• 1.2.3 第二链cDNA反应合成
• 1.2.4 cDNA纯化
• 1.2.5 cDNA-AFLP反应体系
• 1.2.6 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2.7 条带统计
• 1.2.8 差异片段的回收、纯化
• 1.2.9 目的片段的连接与转化
• 1.2.10 阳性克隆的检测及测序
• 1.2.11 序列比对分析
• 2 结果分析
• 2.1 RNA检测
• 2.2 cDNA-AFLP体系优化
• 2.3 cDNA-AFLP结果分析
• 2.4 6%聚丙烯酰胺凝胶回收
• 2.5 阳性克隆的检测
• 2.6 测序结果
• 2.7 差异片段序列的BLAST结果分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 差异表达基因与花青素积累的关系研究
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 果皮RNA提取
• 1.2.2 cDNA合成及检测
• 1.2.3 PyMADS18荧光引物设计及检测
• 1.2.4 荧光定量PCR
• 2 结果分析
• 2.1 果皮总RNA检测
• 2.2 合成cDNA检测
• 2.3 TDF11的BLAST结果
• 2.4 实时荧光定量PCR分析
• 2.5 早红考密斯及其绿色变异系PyMADS18基因表达量分析
• 2.6 早红考密斯及其变异系的PyMADS18基因表达量比较
• 3 讨论
• 4 小结
• 全文结论
• 主要创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表论文
• 致谢