羊脑多头蚴组织结构观察与Tm18基因的克隆

论文摘要

采集自然感染的羊脑多头蚴，在其头节﹑外周囊壁﹑头节附近颈部区囊壁三个部位取材，分别制成组织切片和超薄切片。组织切片用HE法染色后进行光镜观察。结果表明：头节外壁和囊壁外壁结构差别较大；组成吸盘的肌肉组织呈放射状分布，条状分布的肌肉样组织中有空泡和一些颗粒样物质分布，表面可见大量微绒毛，头节可根据结构的巨大差异可以分为吸盘﹑顶突﹑体囊和体腔四部分。囊壁可分为两层，外层为角质层，内层为生发层，大约有200个头节生长在囊壁生发层上。超薄切片经醋酸双氧铀染色后进行透射电镜观察。结果表明：囊壁可明显分为皮层、间质层和实质区。在实质区可见到皮层细胞、实质细胞、成石灰小体细胞、焰细胞、成肌细胞以及排泄系统结构；头节中可见到很发达的肌纤维结构，头节内部有类似于囊壁皮层结构，并可见粗大微毛，但细胞种类明显少于囊壁实质区，含颗粒的囊泡结构明显增多。证明羊脑多头蚴囊壁的结构和细胞种类与其它绦虫相似，并有比较发达的排泄系统。头节与其它绦虫相比数量很多，体积很小，头节边缘无皮层结构，头节连接处含有的肌纤维与其它绦虫相比不发达。采集自然感染绵羊的脑多头蚴，饲喂犬建立动物模型，收集孕卵节片，虫卵经次氯酸钠法破壳，人工肠液激活六钩蚴，提取总RNA。设计特异引物，利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），从多头带绦虫六钩蚴RNA扩增Tm18基因，将扩增产物重组于原核表达载体pGEX-4T-1，构建pGEX-4T-Tm18重组质粒，转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达融合蛋白。表达产物经纯化后进行Western-blot分析证明，所表达的重组蛋白和自然感染羊脑多头蚴血清纯化的IgG有良好的反应原性，可以作为羊脑多头蚴病疫苗研制的候选抗原。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 绦虫及其幼虫结构与多头绦虫免疫学研究进展
• 1 羊脑多头蚴病概述
• 2 绦虫及其幼虫的结构
• 2.1 绦虫的头节与体节
• 2.2 绦虫表面超微结构
• 2.2.1 合胞体
• 2.2.2 微绒毛及其功能
• 2.3 石灰质颗粒
• 3 多头带绦虫免疫学概述
• 3.1 多头蚴虫体抗原生化特性
• 3.2 虫体抗原保护力的研究
• 3.3 免疫原性基因及其保护力的研究
• 3.4 免疫细胞与抗原
• 第二章 多头带绦虫幼虫组织结构观察
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与设备
• 1.2 试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 羊脑多头蚴的获取
• 1.3.2 光镜标本的制备与观察
• 1.3.3 透射电镜标本的制备和观察
• 2 结果
• 2.1 组织结构
• 2.1.1 羊脑多头蚴囊壁
• 2.1.2 头节
• 2.1.3 颈部区
• 2.2 超微结构
• 2.2.1 囊壁的超微结构
• 2.2.2 头节的超微结构
• 2.2.3 颈部区
• 3 讨论
• 3.1 羊脑多头蚴的组织结构
• 3.2 脑多头蚴超微结构
• 第三章 多头带绦虫六钩蚴 TM18 基因的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种与试剂
• 1.1.2 仪器与设备
• 1.1.3 溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 六钩蚴的孵化与激活
• 1.2.2 目的基因的获得
• 1.2.3 pGEX-4T-Tm18 表达载体的构建
• 1.2.4 重组质粒的诱导表达
• 1.2.5 GST-Tm18 可溶性重组蛋白的纯化
• 1.2.6 重组蛋白抗原性分析
• 2 结果
• 2.1 六钩蚴的孵化与激活
• 2.2 多头带绦虫六钩蚴 Tm18 的获得
• 2.2.1 六钩蚴总 RNA 的提取
• 2.2.2 Tm18 的 RT-PCR 扩增
• 2.2.3 重组质粒的鉴定
• 2.2.4 表达产物的 SDS-PAGE
• 2.2.5 表达产物的 Western blot 分析
• 3 讨论
• 3.1 转化的注意事项
• 3.2 关于表达系统
• 3.3 关于 TM18 抗原基因的选择
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介