富士苹果MdCBF1基因的功能分析

论文摘要

植物在生长阶段,会经受很多非生物胁迫,干旱、盐害、低温和氧化胁迫等非生物胁迫严重影响农业生产,并导致环境退化。在这种逆境条件下,植物也会对各种逆境信号作出反应,传递胁迫信号,生理生化做出响应,从而来增强适应性。这就要求对各种功能基因的表达进行精确调控。在植物的受到逆境胁迫时,转录因子对调控相关功能基因的表达发挥着关键作用。AP2/EREBP类转录因子是一类调控植物发育和胁迫耐性的十分重要的转录因子,目前在拟南芥和水稻研究的比较深入,这些转录因子主要与植物的干旱、高盐或低温信号有关。CBF类转录因子属于AP2/EREBP类的一种,参与低温、干旱或高盐等非生物胁迫。目前,在苹果等木本植物的相关研究较少。本文根据报道的苹果CBF1转录因子的cDNA序列从富士苹果中克隆了MdCBF1基因,并对其进行生物信息学分析和逆境胁迫下的表达分析。MdCBF1转录因子基因的核苷酸序列分析表明,该基因含cDNA全长660bp,编码一个含219个氨基酸的蛋白开放阅读框。其核苷酸编码蛋白质理论分子量为23.94kDa,等电点（pI）为5.21。MdCBF1和拟南芥的CBF类转录因子的氨基酸序列具有很高的同源性,其中由56个氨基酸之间构成AP2的核心结构域,在第41和113位分别有CBF蛋白中特异的氨基酸序列PKKRAGRXKFRETRHP和FADSAWR,并且氨基酸序列符合典型的CBF类转录因子特征,N-端和C-端富含酸性氨基酸,推测为转录激活区,N-端有一个富含碱性氨基酸区推测为核定位信号区（NLS）,进一步分析发现,MdCBF1属于DREB-A1亚族类转录因子。Real-Time PCR技术对MdCBF1基因在不同逆境胁迫下的转录水平进行了分析表明,MdCBF1基因的表达受低温、干旱胁迫的诱导,但是对NAA和ABA没有明显响应。组织表达检测表明,MdCBF1在根、茎、叶、种子的表达差别不大。为了进一步分析MdCBF1基因的功能,本研究构建了农杆菌-植物双元表达载体,通过蘸花法转化拟南芥,获得转MdCBF1基因的拟南芥植株。结果表明,过量表达MdCBF1基因的拟南芥获得了很明显低温抗性。但是在干旱胁迫却没有明显抗性。低温处理后,转基因植物的脯氨酸含量高于野生型,并且MDA和电导率要低于野生型拟南芥,可以看出增强了抗寒性。对胁迫应答基因的转录水平进行分析表明,一些基因（如RD29A. COR15a等）的表达在转基因过量表达株系中显著上调。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 植物抵御非生物胁迫的内源性保护物质
• 1.1 甜菜碱
• 1.2 脯氨酸
• 1.3 糖类物质
• 1.4 晚期胚胎发生丰富蛋白
• 2 非生物胁迫的信号转导
• 2.1 非生物胁迫信号感受器和第二信号分子
• 2.2 蛋白磷酸化级联反应
• 2.3 ABA与胁迫信号转导
• 2.4 胁迫响应基因的激活
• 3 参与植物环境胁迫响应的转录因子
• 3.1 转录因子
• 3.2 转录因子的调控作用
• 3.3 CBF类转录因子的研究
• 3.3.1 AP2/EREBP类转录因子
• 3.3.2 CBF类转录因子
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 富士苹果转录因子基因MdCBF1的克隆以及表达分析
• 1 材料
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 化学试剂和酶制剂
• 2 方法
• 2.1 CTAB法提取富士苹果总RNA
• 2.2 总RNA中基因组DNA的去除
• 2.3 反转录合成cDNA
• 2.4 克隆富士苹果MdCBF1基因
• 2.5 DNA序列和数据分析
• 2.6 植物材料处理
• 2.7 苹果总RNA提取、DNA去除和反转录
• 2.8 实时定量PCR分析
• 2.8.1 模板cDNA的相对定量
• 2.8.2 MdCBF1的PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 富士苹果总RNA提取
• 3.2 MdCBF1基因序列分析和比对
• 3.3 MdCBF1氨基酸组成成分及理化性质分析
• 3.4 MdCBF1二级结构预测
• 3.5 MdCBF1三级结构预测
• 3.6 MdCBF1表达模式分析
• 4 讨论
• 第三章 MdCBF1在转基因拟南芥中的功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 细菌菌株和质粒
• 1.1.3 化学试剂和酶制剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 含双CAMV 35S启动子的双元载体YG8406构建
• 1.2.2 电击法转化农杆菌
• 1.3 拟南芥转化
• 1.3.1 植物材料
• 1.3.2 细菌菌株
• 1.3.3 化学试剂和酶制剂
• 1.3.4 拟南芥的培养
• 1.3.5 农杆菌的准备
• 1.3.6 拟南芥蘸花法转化
• 1.3.7 拟南芥转化植株种子的筛选
• 1.4 转基因阳性植株的检测
• 1.4.1 GUS组织化学染色分析
• 1.4.2 转基因阳性植株的PCR检测
• 1.4.3 转基因阳性植株的RT-PCR检测
• 1.5 拟南芥转基因植株的低温和干旱测试
• 1.5.1 抗冻测试
• 1.5.2 脯氨酸测、丙二醛以及电导率测定
• 1.5.3 抗旱测试
• 1.5.4 抗逆相关基因的半定量RT-PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 农杆菌转化双元载体的构建
• 2.2 MdCBF1基因的拟南芥转化及转基因纯系植株的鉴定
• 2.3 拟南芥转基因植株的低温处理
• 2.3.1 转MdCBF1基因的拟南芥植株脯氨酸含量的测定
• 2.3.2 转MdCBF1基因的拟南芥植株丙二醛含量的测定
• 2.3.3 转MdCBF1基因的拟南芥植株电导率含量的测定
• 2.4 拟南芥转基因植株的干旱处理
• 2.5 半定量RT-PCR检测
• 3 讨论
• 全文总结与讨论
• 1 总结
• 2 讨论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 葡萄ERF基因cDNA序列的电子克隆
• 2.2 葡萄ERF基因序列相似性比对以及进化关系分析
• 2.3 葡萄ERF基因及其推导氨基酸序列组成成分与理化性质分析
• 2.4 葡萄ERF氨基酸序列的亲水性/疏水性分析
• 2.5 二级结构功能预测
• 3 讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章
• 致谢