玻璃化冷冻技术的实验研究

论文摘要

目的:观察开放型拉细麦管、闭合型拉细麦管、冷冻环和麦管四种冷冻容器对玻璃化冻融胚胎形态和功能的影响。方法:1、将人三原核受精卵发育形成的300个6-10细胞胚胎随机分为五组:对照组60个、麦管组（Straw）、开放型拉细麦管组（open pulled straw, OPS）、闭合型拉细麦管组（close pulled straw, CPS）和冷冻环（Cryoloop）各60个。通过形态学观察,比较胚胎复苏后存活率。2、收集冻融胚胎培养24h的培养液,全自动生化分析仪测定培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。结果:1、Cryoloop超速玻璃化冷冻胚胎存活率最高,与CPS、OPS和Straw相比,差异具有显著性（P<0.05）;CPS与OPS和Straw相比,胚胎存活率有明显差异（P<0.05）。2、Cryoloop组LDH低于CPS、OPS和Straw三实验组,差异具有显著性（P<0.05）; CPS组LDH低于OPS和Straw两超速玻璃化冷冻组（P<0.05）;Straw组LDH最高,但与OPS组相比,差异无显著性（P>0.05）。结论:Cryoloop对玻璃化冻融胚胎的形态和功能影响最小,CPS次之,OPS虽未获得比Straw更高的形态存活率,但减轻了对胚胎的功能损伤。第二部分氯化胆碱替代氯化钠的磷酸盐缓冲液和非渗透性冷冻保护剂海藻糖对胚胎玻璃化冷冻的影响目的:观察低Na+磷酸盐缓冲液（mPBS）和非渗透性冷冻保护剂海藻糖（Trehalose）对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法:1、将180个人三原核6-10细胞胚胎随机分为三组,对照组、mPBS组和PBS组。用氯化胆碱（choline chloride）代替磷酸盐缓冲液中的氯化钠（NaCl）,配制成改良的低钠磷酸盐缓冲液（mPBS）。再以mPBS和PBS为母液配制玻璃化冷冻液冻融胚胎。比较胚胎存活率;收集冻融胚胎培养24h的培养液,全自动生化分析仪测定培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性并进行比较。2、将180个人三原核6-10细胞胚胎随机分为三组,对照组、海藻糖（D-（+）Trehalose）组和蔗糖（Sucrose）组。分别用海藻糖和蔗糖为非渗透性冷冻保护剂,配制玻璃化冷冻复苏液冻融胚胎。比较胚胎存活率;收集冻融胚胎培养24h的培养液,全自动生化分析仪测定培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性并进行比较。结果:1、mPBS组胚胎存活率略高于磷酸盐缓冲液组,但无显著性差异（P>0.05）;mPBS组LDH活性低于PBS组,差异具有显著性（P<0.05）。2、D-（+）Trehalose组胚胎存活率略高于Sucrose组,但无显著差异（P>0.05）;D-（+）Trehalose组LDH活性低于Sucrose组,亦无显著差异（P>0.05）。结论:1、低Na+磷酸盐缓冲液对玻璃化冷冻胚胎的功能影响小,更适于玻璃化冷冻胚胎。2、D-（+）Trehalose与Sucrose相比,未能显著增加冻融胚胎的存活率,亦未明显减轻对胚胎功能的影响。第三部分玻璃化冷冻胚胎的退化机制研究目的:探讨玻璃化冷冻胚胎的退化机制。方法:1、将人三原核受精卵发育形成的150个6-10细胞胚胎随机分为五组:对照组、Cryoloop组、Straw组、OPS组和CPS组各30个。经罗丹明123 （Rhodamine123,Rh123）染色后在激光扫描共聚焦显微镜下观察并摄片分析荧光强度。2、将人三原核受精卵发育形成的158个6-10细胞胚胎随机分为三组:阳性对照组30个,正常组30个,CPS超速玻璃化冷冻组98个。将对照组和复苏后存活胚胎置于含4%多聚甲醛的PBS固定液中固定,按照TUNEL（脱氧核甘酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶缺口末端标记法）试剂盒说明将固定好的胚胎进行标记和荧光显色,原位检测DNA裂解片断的存在。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下观察并摄片。结果:1、对照组正常胚胎的△Ψm稳定在22.2622±0.67067;冻融胚胎的荧光强度较正常胚胎减弱,△Ψm降低;四玻璃化冷冻组间的胚胎荧光强度亦不等,其中Cryoloop组荧光强度最强,△Ψm最高,与对照组相比,无显著性差异（P﹥0.05）;CPS与OPS两超速玻璃化冷冻组冻融胚胎的△Ψm高于Straw组（P﹤0.05）;CPS和OPS两组比较,无明显差异（P﹥0.05）; CPS、OPS和Straw三冷冻组△Ψm均低于对照组,且具显著性差异2、经TUNEL染色,阳性对照组胚胎全都有绿色荧光表达;正常组胚胎仅6.9%胚胎的有绿色荧光的表达;CPS超速玻璃化冷冻胚胎的表达较正常胚胎明显增多（ 29.1% &6.9% ,P<0.05）。结论:LSCM检测到了玻璃化冷冻胚胎的△Ψm下降,而TUNEL法在玻璃化冻融胚胎中检测到了DNA裂解片断的存在,结合形态学观察,证实了玻璃化冷冻胚胎通过细胞凋亡途径退化。第四部分激光扫描共聚焦显微镜结合免疫细胞化学染色技术在玻璃化冷冻小鼠卵母细胞中的研究应用目的:建立一种观察成熟卵母细胞纺锤体和染色体的方法,并用于观察OPS玻璃化冷冻成熟（MⅡ期）卵母细胞的纺锤体和染色体变化方法:1、运用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的光学切片和三维图像重建技术,结合悬浮细胞的免疫化学方法,观察小鼠MII期卵母细胞的纺锤体和染色体。2、采集小鼠的MⅡ期卵母细胞, OPS法超速玻璃化冷冻,复苏后存活卵母细胞经固定、免疫细胞化学染色后,LSCM观察其纺锤体和染色体;采集小鼠的MⅡ期卵母细胞和精子,卵母细胞行OPS法玻璃化冷冻,复苏后行体外受精并继续培养至囊胚。结果:1、应用LSCM清晰地观察到了成熟卵母细胞纺锤体和染色体的形态,纺锤体和染色体的正常率分别为82%和86%。2、OPS玻璃化冷冻卵母细胞复苏后纺锤体和染色体形态正常率分别为46%和52%,与对照组（76%和70%）相比,具显著性差异（P<0.05）;OPS玻璃化冻融胚胎的存活率、受精率和囊胚形成率分别为58%、36%和19.3%。结论:1、LSCM结合细胞免疫化学能够清晰有效地观察MⅡ期卵母细胞的纺锤体和染色体。2、LSCM结合细胞免疫化学观察到了OPS玻璃化冷冻卵母细胞纺锤体和染色体的损伤,进一步证实了该方法可作为观察MⅡ期卵母细胞纺锤体和染色体的可靠手段;OPS超速玻璃化冷冻卵母细胞具有一定的可行性。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、前言
• 四、正文
• 第一部分：四种冷冻容器对人三原核卵裂期胚胎玻璃化冷冻的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分：氯化胆碱替代氯化钠的磷酸盐缓冲液和非渗透性冷冻保护剂海藻糖对胚胎玻璃化冷冻的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分：玻璃化冷冻胚胎的退化机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分：激光扫描共聚焦显微镜结合免疫细胞化学染色技术在玻璃化冷冻小鼠卵母细胞中的研究应用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 五、本研究的创新与不足之处
• 六、综述
• 人胚胎的玻璃化冷冻进展
• 卵母细胞的玻璃化冷冻进展
• 七 附录
• 八 致谢