gutD基因和SOD2基因植物表达载体构建及gutD基因苜蓿转化体系的优化

论文摘要

干旱、盐碱和低温是自然界普遍存在的抑制植物生长的因素,盐胁迫下,植物离子均衡受到迫害,尤其是细胞质中过多的Na+,对植物的代谢产生毒害。植物细胞为适应胁迫环境,一方面可积累可溶性有机物质;另一方面通过Na+排出或区隔化,并调整K+/Na+比率的机制来消除Na+的毒害。许多研究表明山梨醇含有六个羟基,亲水性能强,能有效维持细胞内的水活度。它不仅仅是生物代谢的中间产物,而且还有许多其它功能,如渗透调节、作为相溶性物质以降低细胞水势、碳源和能量的贮存物质、调节同功酶和消除羟基自由基、还有可能在胁迫条件下稳定蛋白质的结构和功能或可能是小分子量的分子伴侣等;而SOD2基因在裂殖酵母中是控制Na+外流的基因,在裂殖酵母中编码排Na+的质膜Na+/H+逆转运蛋白,在保持裂殖酵母细胞离子均衡上用重要意义。紫花苜蓿又名紫苜蓿（Medicaosativa）,为豆科多年生草本植物。紫花苜蓿是我国大面积种植的优质牧草,营养丰富,抗性强。分布于我国西北、东北、华北、及江淮流域等地,是栽培历史最长、面积最大的重要牧草。具有重要的生态和经济利用价值,如能提高抗逆性,对退耕还草、发展畜牧业和改善生态环境具有十分重要的意义。本研究主要是克隆和构建gutD和SOD2基因的植物表达载体,为基因工程育种奠定良好的基础;同时利用基因枪和农杆菌介导的不同方法优化苜蓿gutD基因的转化体系。以期获得抗旱、抗盐、耐低温的新品系,扩大种植面积,改善生态环境。目前取得的主要研究结果如下:1.gutD基因的植物表达载体的构建通过RT-PCR的方法从大肠杆菌K12中扩增出了gutD基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD18T-vector中,序列分析表明克隆的片段长度为780bp,包含了完整的gutD基因的编码序列,除编码区第72位密码子CTT变为CCT其它序列与所报道的修正序列一致。以BamHⅠ和HindIII限制性内切酶从克隆载体上切取gutD基因,将其连接在相应酶切的中间载体KS上,再以KpnI和BamHI酶切重组子获得具粘性末端的目的片段（gutD）与植物表达载体pCAMBIA2300连接,重组质粒通过双酶切和PCR鉴定正确后,采用直接转化法将pCAMBIA2300-gutD质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并用PCR方法进行了鉴定。2.SOD2基因的植物表达载体的构建通过RT-PCR的方法从裂殖酵母中扩增出了SOD2基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD18T-vector中,序列分析表明克隆的片段长度为1404bp,包含了完整的SOD2基因的编码序列,其它序列与所报道的序列完全一致。以XbaⅠ和HindIII酶切限制性内切酶从克隆载体上切取SOD2基因获得具粘性末端的目的片段（ SOD2）与植物表达载体pCAMBIA2300连接,重组质粒通过PCR鉴定正确后,采用直接转化法将pCAMBIA2300- SOD2质粒导入根癌农杆菌GV3101,并用PCR方法进行了鉴定。3.gutD基因转化苜蓿的研究利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将gutD基因转入苜蓿。结果表明:（1）适宜侵染浓度OD600为0.3;（2）用液体分化培养基活化农杆菌,侵染120min;（3）最佳共培养时间3d、共培培养基pH为5.5;（4）400 mg/L头孢霉素可有效抑制农杆菌;（5）22℃下暗培养60d,延迟10～15d选择时,Kan能对转化体有效筛选。先用50mg/L Kan筛选两个月,再用去Kan筛选一个月,然后在50mg/L Kan生根培养基上筛选。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 第一部分 文献综述
• 1 植物抗逆基因工程研究进展
• 1.1 植物耐盐的机理
• 1.2 耐盐相关基因的克隆
• 1.3 6-磷酸山梨醇脱氢酶（gutD）的研究进展
• +/H⁺逆转运蛋白的分子特征与研究进展'>1.4 酵母Na⁺/H⁺逆转运蛋白的分子特征与研究进展
• 2. 苜蓿基因工程研究进展
• 2.1 品种改良
• 2.2 抗病性
• 2.3 抗虫性
• 2.4 抗除草剂
• 2.5 抗逆性
• 2.6 次生代谢
• 2.7 植物疫苗
• 3 农杆菌介导
• 3.1 农杆菌及其侵染机理
• 3.2 农杆菌转化的研究进展
• 4. 本实验的目的和意义
• 5 技术路线
• 第二部分 GUTD 基因植物表达载体的构建与SOD2 基因植物表达载体的构建
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2 实验结果与分析
• 2.1 大肠杆菌gutD 基因的克隆
• 2.2 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pimbe） SOD2 基因的克隆
• 第三部分 农杆菌介导和基因枪法的6-磷酸山梨醇脱氢酶基因的转化
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 选择培养集中抗生素（Cef）浓度的确定
• 2.2 选择培养集中卡那霉素（Kan）选择压的确定
• 2.3 不同的转化方法对转化效率的影响
• 3. 小结与讨论
• 3.1 小结
• 3.2 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 图版