雌核发育草鱼群体的建立及其主要生物学特性研究

论文摘要

草鱼是我国重要的淡水经济养殖鱼类之一。近年来,草鱼种质资源退化严重,病害频繁,给草鱼养殖业带来巨大的损失。雌核发育是快速建立纯系的有效手段。建立雌核发育草鱼群体,在基础理论研究方面,对研究草鱼性别决定机制、染色体定位、草鱼遗传图谱构建等具有重要意义；在生产应用方面对实现草鱼单性养殖及快速选育生长速度快、抗病能力强的优良草鱼新品系具有重要意义。为快速改良草鱼遗传性状,建立具目标经济性状的草鱼纯系,我们设计了以下实验方案：首先运用雌核发育技术快速建立纯系,并选则具目标性状的雌核发育草鱼进行二次雌核发育诱导,快速建立具有目标性状的雌核发育草鱼纯系；然后,对部分雌核发育草鱼进行性反转诱导,利用生理雄性雌核发育草鱼与全雌的雌核发育草鱼交配制备大量用于生产的全雌性的高纯系亲本；进而以优良雌核发育草鱼纯系为母本,普通草鱼为父本,大规模生产优良草鱼苗种,供草鱼养殖业的需求。本文通过对草鱼雌核发育技术优化,大大提高了雌核发育二倍体诱导率,目前已经建立了抑制第二极体排出和抑制第一次卵裂雌核发育草鱼群体,并对其主要生物学特性进行研究。首次证实雌核发育草鱼群体全部为雌性,并开展了雌核发育草鱼的性反转研究。因雌核发育草鱼在形态和生理上同普通草鱼无法区分,本文寻找雌核发育草鱼分子生物学标记方面做了大量工作,为指导雌核发育草鱼群体遗传性状改良,培育生长速度快、抗病能力强的优良草鱼品系打下坚实的基础,并提供了理论依据。主要研究内容及结果如下：1.首次采用经紫外线照射遗传灭活的异源四倍体鲫鲤二倍体精子诱导草鱼雌核发育,通过优化温度休克参数,获得了较高存活率的抑制第二极体排出及抑制第一次卵裂雌核发育草鱼。2.对雌核发育草鱼早期胚胎发育进行了仔细的观察。雌核发育单倍体胚胎因患有典型的单倍体综合症而不能存活；雌核发育二倍体拥有正常的形态学特征及胚胎发育过程,胚胎孵化所需的时间跟孵化温度密切相关。水溶氧量的高低直接影响雌核发育草鱼胚胎的成活率。3.从形态学特征、红细胞形态学特征及体积大小、染色体和核型分析研究等多方面对雌核发育草鱼的倍性进行检测,证实其为二倍体(2n=48)。4.对雌核发育草鱼群体的微卫星分析表明其遗传纯度大大提高且未受父本染色体基因的污染。利用RAPD从分子水平寻找到雌核发育草鱼与普通草鱼群体的分子标记,并成功转化为SCAR标记。5.连续5年对雌核发育草鱼的生长及性腺发育情况研究发现：雌核发育草鱼个体间生长速度分化明显；所有雌核发育草鱼均为雌性,88%个体性腺正常,可推测草鱼性别决定机制为雌性同配型。6.对雌核发育草鱼性腺Foxl2基因部分序列进行克隆和序列分析。Foxl2基因在脊椎动物中同源性高,主要在脑、垂体、卵巢及鳃中表达,精巢中不表达。利用该特点可以从分子水平鉴定草鱼性别。7.对雌核发育草鱼线粒体全序列测序及分析结果表明：雌核发育草鱼线粒体遵循严格的母性遗传,与普通草鱼的线粒体DNA遗传结构具有同一性。通过连续5年的雌核发育诱导,建立了抑制第二极体排出和抑制第一次卵裂两个大规模雌核发育草鱼群体。一方面,对全雌的雌核发育进行性反转诱导实验,制备生理雄性的雌核发育草鱼,用于与雌核发育草鱼交配生产大量的全雌性纯系草鱼亲本。另一方面,以雌核发育草鱼为母本,普通草鱼为父本,大规模制备生长速度快、抗病能力强的优良苗种。目前,抗病草鱼优良苗种已广泛推广,取得了非常好的社会和经济效益。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 鱼类雌核发育研究
• 1.2 鱼类天然雌核发育研究
• 1.3 人工诱导鱼类雌核发育
• 1.3.1 人工诱导鱼类雌核发育方法
• 1.3.2 雌核发育二倍体的鉴别
• 1.3.3 鱼类雌核发育的意义和应用前景
• 1.3.4 人工诱导鱼类雌核发育存在的主要问题
• 1.4 鱼类性别决定和分化
• 1.5 人工诱导鱼类性反转
• 1.6 草鱼概述
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 雌核发育二倍体草鱼人工诱导的研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 异源精子的选择及不同供体精子紫外线照射所需时间比较
• 2.2.2 温度休克法制备抑制第二极体排出及抑制第一次卵裂雌核发育草鱼
• 2.2.3 抑制第二极体排出及抑制第一次卵裂雌核发育草鱼群体的建立
• 2.3 讨论
• 2.3.1 精子遗传灭活
• 2.3.2 染色体加倍方法
• 2.3.3 鱼类人工雌核发育中存在的问题
• 2.3.4 人工雌核发育二倍体草鱼群体建立的意义
• 第三章 雌核发育草鱼的胚胎发育及孵化温度、水溶氧量对胚胎发育的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 雌核发育草鱼胚胎发育的观察
• 3.1.3 孵化温度对雌核发育草鱼胚胎的影响
• 3.1.4 水溶氧量对雌核发育草鱼胚胎的影响
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 雌核发育草鱼卵的形态及胚胎发育
• 3.2.2 孵化温度对胚胎发育的影响
• 3.2.3 水溶氧量对胚胎发育的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 人工雌核发育草鱼形态学特征、红细胞大小及染色体检测
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 雌核发育草鱼同普通草鱼的形态学特征比较
• 4.2.2 雌核发育草鱼同普通草鱼的红细胞大小比较
• 4.2.3 雌核发育草鱼染色体观察
• 4.3 讨论
• 4.3.1 从形态学特征判定雌核发育鱼真伪
• 4.3.2 红细胞体积大小与染色体倍性成正比
• 4.3.3 雌核发育鱼中微小染色体的探讨
• 第五章 雌核发育二倍体草鱼群体微卫星分析、RAPD分子标记及SCAR标记转化
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 微卫星标记的检测
• 5.2.2 RAPD方法寻找雌核发育草鱼与普通草鱼的分子标记
• 5.2.3 SCAR标记的转化与验证
• 5.3 讨论
• 5.3.1 微卫星引物适用性的讨论
• 5.3.2 RAPD分子标记的应用及SCAR标记转化
• 第六章 雌核发育二倍体草鱼的性腺发育研究及性反转的诱导
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 雌核发育草鱼性腺组织学观察及性别比例统计
• 6.1.2 雌核发育草鱼性反转的诱导及早期性腺组织切片检测
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 雌核发育草鱼性腺观察
• 6.2.2 性反转雌核发育草鱼的性腺观察
• 6.3 讨论
• 6.3.1 雌核发育后代生长与性腺发育研究
• 6.3.2 雌核发育草鱼的性反转诱导
• 第七章 雌核发育草鱼Foxl2基因克隆及表达研究
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 雌核发育草鱼Foxl2 cDNA的分子克隆
• 7.1.2 Foxl2基因在不同组织的表达
• 7.1.3 RT-PCR检测雌核发育草鱼性腺中Foxl2的表达
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 雌核发育草鱼Foxl2 cDNA和氨基酸部分序列拼接及比较
• 7.2.2 雌核发育草鱼Foxl2各组织的表达
• 7.2.3 大规模检测雌核发育草鱼性腺中Foxl2的表达
• 7.3 讨论
• 第八章 雌核发育草鱼线粒体全基因组测序与分析
• 8.1 材料和方法
• 8.1.1 实验材料
• 8.1.2 总DNA的提取
• 8.1.3 引物设计和PCR扩增
• 8.1.4 线粒体基因组各片段的测序
• 8.1.5 全序列的拼接
• 8.1.6 全序列分析方法
• 8.2 结果与分析
• 8.2.1 雌核发育草鱼线粒体基因组结构分析
• 8.2.2 蛋白质编码区分析
• 8.2.3 非编码区及RNA分析
• 8.2.4 雌核发育草鱼、普通草鱼及异源四倍体鲫鲤线粒体全基因组的比较分析
• 8.3 讨论
• 第九章 总结
• 参考文献
• 博士学习期间撰写、发表的主要论文及获奖情况
• 致谢