首页> 正文

H5亚型血凝素单抗库的构建、广谱中和单抗的发现及其对H5N1禽流感的治疗研究

2020-11-28阅读(128)

H5亚型血凝素单抗库的构建、广谱中和单抗的发现及其对H5N1禽流感的治疗研究

论文摘要

2003年以来，高致病性H5N1禽流感病毒（H5N1病毒）在禽类中的持续流行和不断发生的人类感染事件使人们担心H5N1病毒可能持续进化成引发人类流感大流行的大流感病毒株。为此，研制H5N1病毒的疫苗和抗体治疗药物成为当前应对H5N1病毒引发潜在流感大流行的研究热点，而H5N1病毒最主要的中和抗体来自于表面糖蛋白血凝素（HA），因此HA成为主要研究靶标。H5N1病毒具有高度变异性，故疫苗研制的关键是疫苗株的选择。根据分子进化树分析预测结果显示H5N1病毒HA基因已演变成至少10种不同抗原性特征的变异分支（Clade 0-9）。虽然病毒抗血清可真实地反映出病毒的抗原性表现型，但是H5N1病毒新变异株的不断出现和低免疫原性特点使及时制备各种雪貂抗血清变得困难。建立一个H5亚型血凝素单抗库（H5 MAb Panel），将有助于H5N1病毒新流行株的抗原性变异监测，并指导疫苗株的选择。为此开展了如下工作：（1）利用分子进化树分析1997～2007年分离的114株H5N1病毒的HA基因，并选择位于进化树不同分支的40株H5N1病毒代表株（H5N1 Virus Panel）用于单抗的制备和鉴定；（2）利用Clade 1、2-1、2．2、2．3、8等五种变异分支的H5N1病毒免疫和筛选，建立一个包含476株单抗的H5亚型血凝素单抗库；（3）利用血凝抑制试验（HI）分析476株H5单抗对40株H5N1病毒的反应性，把单抗分成九种反应类型（M1-M9），并发现60株属于M1、M2类的“广谱单抗”能与40株病毒全部或基本全部反应；（4）从中选出15株代表性单抗组成H5 MAbPanel对40株H5N1病毒进行细胞中和试验分析，进一步把15株单抗分成三类，代表H5 MAb三种不同的表位识别特征（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），其中“广谱单抗”属于第Ⅰ类；（5）细胞中和试验结果反映了H5N1病毒的抗原性特征，并把40株H5N1病毒分成四类，代表H5亚型血凝素的四种不同抗原性（A、B、C、D）。A类病毒大部分为Clade 2．1（印尼流行株）；B类病毒最具多样性，除了Clade 1（越南流行株），还包括Clade 0、4、5、7、8、9等；C类病毒主要为Clade 2．2（青海类似株，QH-like）；D类主要是Clade 2．3．4（福建类似株，FJ-like）。总之，本研究成功建立了一个H5 MAb Panel，可为H5N1病毒的变异监控、抗原性分析和疫苗株选择更新提供有用的研究工具。人类感染H5N1病毒具有高致死率，可能原因是病毒感染人体后会迅速扩散到体内多个组织器官，导致严重的并发症。流感病毒传统的抗病毒治疗药物（离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂）对H5N1病毒疗效一般，且疗效依赖于病毒感染早期或感染之前开始用药，而实际临床病人一般都在出现症状的发病中后期才被发现。因此寻找H5N1病毒的治疗新途径势在必行。近年来，被动免疫日益被用于治疗急性传染病，利用中和抗体快速清除体内病毒，因此H5血凝素中和单抗成为治疗H5N1病毒的一种选择。鉴于H5N1病毒HA抗原性存在多种变异分支，理想的治疗单抗应对不同变异分支有广谱疗效。为此在H5N1病毒动物感染模型中对上述获得的H5广谱单抗进行治疗研究：（1）建立了H5N1病毒动物感染模型（BALB／c小鼠和家猫），确定了病毒对动物的一周致死剂量，鉴定了广谱单抗及其片段在不同动物体内半衰期等生物学性质，选择13D4、13D4F（ab’）2开展治疗研究；（2）在小鼠体内证明广谱单抗13D4对Clade 1、2．1、2．2、2．3等已引发人类感染的四种变异分支的H5N1病毒感染均有良好疗效，显示了广谱疗效，而且疗效与单抗给药时间和剂量有关，越早给药，用药剂量越小；（3）组织病毒滴度分离研究显示，广谱单抗在体内能高效清除病毒，使得单抗在病毒引发肺外多器官感染时仍有效，单抗能在病毒感染24小时内将肺组织中的病毒完全清除；（4）利用片段单抗13D4 F（ab’）2治疗H5N1病毒感染鼠，显示疗效不如13D4全抗体，但明显优于抗流感病毒药物奥赛米韦（达菲）；（5）进一步比较不同抗体亚类广谱单抗对H5N1病毒感染鼠的治疗效果，发现IgG2a和IgG2b亚类的疗效明显好于IgG1，而IgM和IgG3亚类无疗效，提示广谱单抗的治疗机制可能与抗体Fc段介导的ADCC、补体激活或免疫调理有关；（6）单抗13D4还对H5N1病毒感染家猫有良好的异源抗体治疗效果；（7）为认识广谱单抗识别的保守表位，利用逃逸突变分析方法鉴定出单抗13D4至少结合两个位点氨基酸（第152位和第182位），相应突变株对小鼠的毒力均下降，提示这两个位点与病毒受体结合区有关；（8）HI试验显示任意一个点的突变病毒株均不能完全逃避单抗13D4的结合，动物实验显示单抗13D4对逃逸病毒感染鼠虽疗效下降但仍可有效保护。总之，本研究获得的13D4等H5亚型血凝素广谱中和单抗对同源和异源动物感染H5N1病毒均有良好疗效，而且广谱单抗通过结合H5N1病毒血凝素上至少2个保守的关键位点，增强了单抗应对病毒单一突变的治疗能力。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 前言
  • 1.1.流感病毒的概述
  • 1.1.1.流感病毒的分类与命名
  • 1.1.2.流感病毒形态与化学组成
  • 1.1.3.流感病毒的分子生物学
  • 1.1.4.历史上的全球性大流感（Pandemic）
  • 1.2.禽流感病毒的概述
  • 1.2.1.病毒的宿主
  • 1.2.2.流感病毒的变异与进化
  • 1.2.3.H5N1禽流感病毒的起源、扩散和进化
  • 1.2.4.H5N1禽流感病毒爆发大流行的潜在可能性
  • 1.3.H5N1禽流感病毒的感染与治疗
  • 1.3.1.人类感染H5N1禽流感病毒的发病机制
  • 1.3.2.H5N1禽流感病毒感染的毒力影响因子
  • 1.3.3.H5N1禽流感病毒的动物感染模型
  • 1.3.4.流感抗病毒药物
  • 1.4.本论文的研究意义和主要研究内容
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1.主要仪器
  • 2.2.主要耗材
  • 2.3.主要试剂和实验动物
  • 2.4.常用溶液和培养基的配制
  • 2.5.实验方法
  • 2.5.1.分子克隆相关操作
  • 2.5.2.重组杆状病毒表达重组血凝素蛋白
  • 2.5.3.细胞免疫荧光试验
  • 2.5.4.流感病毒的培养和灭活
  • 2.5.5.流感病毒的滴度测定
  • 2.5.6.流感病毒基因的获得和序列分析
  • 2.5.7.流感病毒对小鼠的免疫
  • 2.5.8.融合杂交瘤的制备与筛选
  • 2.5.9.杂交瘤细胞的培养
  • 2.5.10.单抗腹水的诱导
  • 2.5.11.单抗腹水的纯化
  • 2的制备'>2.5.12.单抗F（ab'）2的制备
  • 2.5.13.单抗Fab的制备
  • 2.5.14.血凝抑制试验（Hemagglutination Inhibition Assay, HI）
  • 2.5.15.细胞微孔中和实验
  • 2.5.16.酶联免疫吸附分析（ELISA）
  • 2.5.17.抗体半衰期的测定
  • 2.5.18.流感病毒逃逸突变株的诱导
  • 2.5.19.流感病毒对小鼠的感染和组织采集
  • 2.5.20.流感病毒对家猫的感染和组织采集
  • 2.5.21.组织病毒滴度测定
  • 2.5.22.免疫组化分析
  • 第三章 结果与分析
  • 3.1.大容量H5亚型血凝素单克隆抗体库的构建
  • 3.1.1.H5N1禽流感病毒代表株（H5N1 Virus Panel）的选择
  • 3.1.2.H5亚型血凝素单抗库的建立和广谱单抗的发现
  • 3.1.3.单毒株免疫和多毒株免疫的不同效果
  • 3.1.4.H5亚型血凝素单抗盘（H5 MAb Panel）及其对病毒的抗原性分析
  • 3.1.5.治疗性H5亚型血凝素广谱单抗的选择及活性鉴定
  • 3.1.6.本节小结
  • 3.2.H5亚型血凝素广谱中和单抗的治疗研究
  • 3.2.1.广谱单抗对小鼠（同源动物）H5N1禽流感病毒感染的疗效
  • 3.2.2.单抗13D4对家猫（异源动物）H5N1禽流感病毒感染的疗效
  • 2片段疗效探索并与.达菲"比较'>3.2.3.单抗13D4 F（ab'）2片段疗效探索并与.达菲"比较
  • 3.2.4.单抗13D4的治疗机制
  • 3.2.5.本节小结
  • 3.3.H5广谱单抗的分子基础
  • 3.3.1.单抗13D4的潜在结合位点
  • 3.3.2.单抗13D4对逃逸突变病毒的治疗效果
  • 3.3.3.本节小结
  • 第四章 讨论
  • 4.1.H5亚型血凝素广谱单抗的免疫筛选策略
  • 4.2.H5N1禽流感病毒的抗原性漂移
  • 4.3.单抗在H5N1禽流感病毒抗原性分析和疫苗株鉴选中的作用
  • 4.4.被动免疫及广谱中和单抗对H5N1禽流感治疗的重要性
  • 4.5.异源抗体治疗的可行性
  • 4.6.单抗13D4结合位点的生物学性质
  • 4.7.未来潜在的工作
  • 结论
  • 创新点
  • 参考文献
  • 在校期间获得的奖励和科研成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

    • [1].移动客户端中的H5技术运用[J]. 无线互联科技 2019(22)
    • [2].基于微信结合H5技术的大学物理实验教学创新研究[J]. 大学物理 2019(12)
    • [3].从中国新闻奖获奖作品看H5制作趋势与技巧[J]. 中国传媒科技 2019(12)
    • [4].试论H5产品在高校宣传中的运用[J]. 湖南大众传媒职业技术学院学报 2019(03)
    • [5].H5技术在高职电商专业简历设计中的应用[J]. 国际公关 2020(01)
    • [6].做好重大主题的“沉浸式”新媒体产品——以苏报集团3D版H5《我的苏州70年》为例[J]. 新闻文化建设 2020(01)
    • [7].H5新闻产品的视觉传播分析[J]. 新闻传播 2020(06)
    • [8].H5游戏用于品牌营销的可行性分析[J]. 艺术科技 2019(04)
    • [9].H5广告的传播价值及效果有限性的反思[J]. 青年记者 2017(32)
    • [10].探析广告设计课程中引入H5广告的必要性与方法[J]. 工业设计 2018(06)
    • [11].制约H5广告发展的不利因素及未来发展趋势[J]. 新闻研究导刊 2018(16)
    • [12].基于受众心理的H5广告表现策略分析[J]. 视听 2017(03)
    • [13].H5技术在移动客户端中的应用研究[J]. 电脑知识与技术 2017(11)
    • [14].浅析H5在两会报道中的运用——以“两会喊你加入群聊”为例[J]. 东南传播 2017(04)
    • [15].浅谈H5在新闻报道中的运用[J]. 新闻研究导刊 2017(06)
    • [16].H5技术在移动客户端中的应用[J]. 数码世界 2019(12)
    • [17].多力坚果饮:用8万元做出一支刷爆朋友圈的H5[J]. 新营销 2017(Z1)
    • [18].全新蜕变的设计风格 年轻化造型吸睛 中国一汽 红旗H5[J]. 中国汽车市场 2017(09)
    • [19].基于用户体验的微信H5界面设计研究[J]. 明日风尚 2017(08)
    • [20].H5在翻转课堂中的应用实践[J]. 现代职业教育 2017(15)
    • [21].浅析报纸和H5新闻中界面的“视觉引导”设计——以《华西都市报》和《第29届中国新闻奖获奖作品》为例[J]. 成都航空职业技术学院学报 2020(03)
    • [22].动画元素在H5广告交互设计中的应用研究[J]. 科技经济导刊 2020(30)
    • [23].基于“H5+微信”的科技期刊新媒体融合[J]. 中国科技期刊研究 2017(10)
    • [24].互动广告新形式——H5广告研究[J]. 新闻研究导刊 2016(09)
    • [25].羧甲基葡聚糖对H5亚型禽流感灭活疫苗免疫效果的影响[J]. 中国家禽 2016(09)
    • [26].面向广播电视技术专业群的H5精品资源共享课程建设与教学改革融合研究[J]. 现代职业教育 2019(34)
    • [27].从“现象级”传播看集体记忆构建——以主流媒体国庆系列微博话题与H5为例[J]. 新闻世界 2020(11)
    • [28].移动互联网时代H5广告的媒介生态位研究[J]. 传播与版权 2020(03)
    • [29].美丽乡村发展大会南海网H5产品成宣传“新名片”[J]. 世界热带农业信息 2017(Z2)
    • [30].初探H5在非物质文化遗产宣传中的作用[J]. 艺术科技 2018(06)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  ;  

    H5亚型血凝素单抗库的构建、广谱中和单抗的发现及其对H5N1禽流感的治疗研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2025 毕速过 版权所有 鄂ICP备12018319号-5