四种双生病毒的分子鉴定

论文摘要

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链DNA病毒,在世界范围内广泛发生,并已在多种重要经济作物上造成严重损失。自20世纪90年代起,我国的云南、广西等省份的烟草、番茄、南瓜和番木瓜上已发现了多种双生病毒。为了进一步弄清双生病毒在我国的发生、分布及危害情况,我们对海南和广西的双生病毒进行了分子鉴定。 利用双生病毒的简并性引物PA和PB,对采自海南和广西的胜红蓟、假马鞭、黄花捻、空心莲子草、赛葵和南瓜样品进行了PCR检测。序列分析表明,33个病毒样品均为双生病毒,且可分为8种类型,其中类型Ⅱ～Ⅴ与已报道的双生病毒十分相似,而类型Ⅰ、Ⅶ和Ⅷ则与已报道的双生病毒的差异较大;类型Ⅵ与中国南瓜曲叶病毒（Squash leaf curl China virus,SLCCNV）十分相似,但我国SLCCNV未报道有DNA-B。为此,对类型Ⅰ、类型Ⅵ、类型Ⅶ及类型Ⅷ病毒分离物的全基因组结构进行了研究。 类型Ⅰ只有Hn51一个样品,采自海南呈黄脉症状的空心莲子草。Hn51基因组全长为2745个核苷酸（nts）,序列比较表明,Hn51与胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow mosaic virus,AYVV）的相似性最高,为65.2%。根据双生病毒分类原则,Hn51是菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）的一个新种,将其命名为空心莲子草黄脉病毒（Alternanthera yellow vein virus,AlYVV）,这是我国首次在水生植物上分离到双生病毒。用特异性引物对Hn51样品进行了DNA-B和DNAβ的研究,但都没有发现这两种小分子DNA的存在。 类型Ⅷ样品采自海南呈曲叶症状的黄花捻,对病毒分离物Hn57的全基因组进行了测定,序列分析表明Hn57与云南烟草曲叶病毒（Tobacco leaf curl Yunnan virus,TbLCYNV）的相似性最高,为71.0%,因而为双生病毒的一个新种,命名为黄花捻曲叶病毒（Sida leaf curl virus,SiLCV）。在Hn57和Hn60中还发现伴随有卫星DNAβ和DNA1两种小分子,其中Hn57 DNAβ和Hn60 DNAβ之间的相似性为93.8%,它们与胜红蓟黄曲叶病害（Ageratum yellow leaf curl disease）伴随的DNAβ（AYLCDβ02）的相似性最高,分别为51.5%和52.1%;Hn57 DNA1和Hn60 DNA1之间的核苷酸序列相似性为83.8%,与已报道的DNA1分子的相似性相对较高,为58.2～79.3%,

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 双生病毒的分类与基因组结构
• 1.1 玉米线条病毒属（Mastrevirus）
• 1.2 甜菜曲顶病毒属（Curtovirus）
• 1.3 番茄伪曲顶病毒属（Topocuvirus）
• 1.4 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）
• 2 双生病毒病害复合体
• 2.1 双组分双生病毒形成的病害复合体
• 2.2 单组分双生病毒与其伴随的小分子形成的病害复合体
• 3 双生病毒的侵染过程
• 3.1 双生病毒的粒子包壳和介体传毒
• 3.2 双生病毒在植物体内的增殖
• 3.3 双生病毒的转录
• 3.4 双生病毒的移动
• 4 双生病毒的致病因子及其可能的作用途径
• 4.1 调控细胞周期的致病因子
• 4.2 干扰细胞运动的致病因子
• 4.3 抑制基因沉默的致病因子
• 5 双生病毒基因组的变异与进化
• 5.1 双生病毒基因组的变异
• 5.2 双生病毒基因组的进化
• 6 双生病毒的检测方法
• 7 立题依据
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 病毒分离物
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 常用生化试剂及仪器
• 1.4 常用缓冲液的配制
• 2 方法
• 2.1 三抗体夹心酶联免疫吸附法（TAS-ELISA）
• 2.2 植物总DNA提取（CTAB法）
• 2.3 总DNA的少量纯化
• 2.4 PCR反应
• 2.5 PCR产物的纯化
• 2.6 DNA克隆技术
• 2.7 重组质粒鉴定
• 2.8 重组质粒的鉴定
• 2.9 Southern blot分析
• 2.10 侵染性克隆的转化
• 2.11 农杆菌接种
• 第三章 实验内容
• 第一节 采自海南和广西样品上的双生病毒的快速检测
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒分离物
• 1.2 植物总DNA提取和纯化
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 PCR产物的纯化
• 1.5 序列分析
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第二节 空心莲子草上分离到的双生病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒分离物
• 1.2 植物总DNA提取
• 1.3 DNA-A克隆以及DNA-B组分和DNAβ的检测
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第三节 黄花捻曲叶病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 抗原表位谱（epitope profile）测定
• 1.3 植物总DNA的提取和病毒基因组的克隆和序列测定
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 抗原表位谱测定
• 2.2 Hn57 DNA-A基因组结构及序列分析
• 2.3 DNA-B组分的检测
• 2.4 卫星DNAβ分子的结构特征与序列分析
• 2.5 DNA1分子的结构与比较
• 3 讨论
• 第四节 赛葵黄花叶病害复合体的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 总DNA提取
• 1.3 基因组的扩增
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒基因组DNA-A的结构及与其它双生病毒的比较
• 2.2 defDNAβ和DNAβ的结构和序列分析
• 2.3 RecDNA-Aβ的结构和序列分析
• 2.4 DNA1的结构与序列分析
• 3 讨论
• 第五节 从南瓜上分离到的一种双组分的双生病毒
• 1 材料与方法
• 1.1 病毒来源
• 1.2 血清学测定
• 1.3 DNA-A全长基因组的克隆和序列测定
• 1.4 DNA-B全长基因组的克隆和序列测定
• 1.5 DNA-A和DNA-B比较和分析
• 1.6 DNA-A和DNA-B侵染性克隆的构建
• 1.7 农杆菌介导的植物接种
• 2 结果与分析
• 2.1 血清学关系
• 2.2 G25 DNA-A和Hn61 DNA-A的结构和序列比较
• 2.3 G25 DNA-B和Hn61 DNA-B的结构和序列比较
• 2.4 共同区分析
• 2.5 致病性测定
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录