基底拉伸和压缩加载对肝癌细胞接触抑制丧失生长行为的影响

论文摘要

肝癌细胞在体外二维培养中存在明显的接触抑制丧失现象,突出表现为细胞恶性增殖行为。细胞接触抑制生长属细胞相互作用导致的社会行为,而超越单个细胞界线并把群体细胞联系在一起的大骨架网络体系,与细胞社会行为及其调控密切相关。其中,以大骨架网络结构为载体的预张力对细胞生长增殖等生命活动具有直接的调控作用。肿瘤细胞骨架结构存在缺陷,由此引起的预张力调节异常与肿瘤细胞接触抑制丧失是否则相关,本文通过力学加载手段对肝癌细胞生长基底进行拉伸与收缩刺激,观测细胞骨架预张力变化对细胞连结及细胞增殖的影响。研究结果对揭示肿瘤细胞接触抑制丧失成因具有一定意义。目的通过对肝细胞与肝癌细胞E钙粘素分布、表达和运动生长行为与其连结状态和骨架预张力状态相关关系的研究,探索肝癌细胞接触抑制丧失机制。方法运用显微形态学,图像分析软件,免疫荧光染色,激光共聚焦显微成像技术等研究手段,分别对不同生长密度的肝癌细胞和肝细胞形态特征、细胞骨架变化和运动变形能力,以及E钙粘素表达和分布变化进行检测和定量分析。通过细胞同步化,MTT和流式细胞仪等实验技术分别对机械拉伸和收缩刺激后肝癌细胞细胞骨架变化和增殖进行检测和定量分析。结果1)肝细胞和肝癌细胞102、104生长密度,肝癌中E钙粘素平均表达量(77.43±5.77,76.06±5.61)显著高于肝细胞(15.81±2.23,16.96±1.12),p<0.05;E钙粘素分布特征为:肝细胞E钙粘素主要沿细胞膜呈散点状分布,肝癌细胞中则呈弥散状分布;两种细胞运动迁移状态无明显差异,均表现为运动速率较高、轨迹离散等特征;MTT检测肝细胞和肝癌细胞的生长曲线趋势相近;2)肝细胞和肝癌细胞106生长密度,肝癌细胞E钙粘素(53.89±3.31)表达仍高于肝细胞(28.23±1.23),E钙粘素表达量在两种细胞的不同区域存在明显差异:肝细胞接触区域E钙粘素表达量为28.94±1.15,肝癌细胞接触区域E钙粘素表达量为19.32±7.17,p<0.05。肝细胞E钙粘素分布出现向相邻细胞接触面聚集,而非接触面未见E钙粘素分布,肝癌细胞E钙粘素仍弥散分布于细胞表面,细胞非接触面存在E钙粘素分布;连续定点观测肝细胞和肝癌细胞运动能力,肝细胞运动处于抑制状态,肝癌细胞持续形变和运动,两种细胞的运动速率和净迁移距离存在显著性差异,p<0.05;两种细胞生长变化趋势不同,肝细胞生长曲线在达到峰值0.79后,立刻衰减至0.11,肝癌细胞下降幅度相对较低(0.81到0.29);3)肝细胞和肝癌细胞106接种且形成融合生长层,两种细胞E钙粘素表达出现调整:肝细胞平均水平略有下降,但接触区域则升高至36.49±1.29,肝癌细胞E钙粘素平均水平明显下降至28.58±2.72,但接触区域则无明显变化(22.87±2.08),两种细胞E钙粘素分布特征为:在肝细胞中E钙粘素进一步向相邻细胞间接触面聚集,呈现细小聚集亮斑,肝癌细胞E钙粘素在相邻细胞接触面虽有所增多,但与细胞游离面相比无明显差异,保持在细胞表面弥散分布态势。持续培养48小时,肝细胞群落中会出现圆形或椭圆形“空洞”,肝癌群落则大面积堆砌圆形细胞,通过激光共聚焦显微镜分别逐层扫描肝细胞和肝癌细胞群落,三维立体重建这两种细胞核形态,发现肝细胞核明显变形为长梭样,而肝癌细胞核仍旧呈现圆形;4)对于贴壁生长且彼此接触肝癌HepG2进行基底拉伸和收缩,幅度分别为10%、30%,50%,实验显示,细胞在加载前后细胞取向变化明显(p<0.05)70%以上细胞沿加载方向伸展,6h后恢复随机取向;拉伸10%后细胞S期为26.85±1.32%,对照组为31.91±1.13%,二者无显著性差异;收缩10%后,S期为29.24±2.17%,对照组为30.33±2.67%,二者无显著性差异。细胞周期时相变化没有显著性变化,p>0.05;随着拉伸和收缩加载幅度变大,细胞凋亡比例逐渐增加。结论1)肝细胞生长密度与其细胞间E钙粘素分布密度呈正相关,并与其运动变形能力和生长增殖能力呈负相关;2)肝癌细胞生长密度对其细胞间E钙粘素分布密度有一定影响,但对细胞运动变形能力和生长增殖影响不明显;3)肝癌细胞对力学刺激的响应不明显,但凋亡比例和随加载幅度正相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 国内外研究现状
• 1.1.1 细胞接触抑制与增殖调控
• 1.1.2 肿瘤细胞非接触抑制与增殖失控
• 1.1.3 肿瘤细胞非接触抑制与预张力调节
• 1.2 问题的提出及研究意义
• 1.3 研究目的和研究内容
• 1.4 技术路线
• 2 肝癌细胞生长密度不同对其运动和生长的影响
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料、试剂和仪器设备
• 2.2.1 实验仪器与设备
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 主要试剂的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞培养方法
• 2.3.2 显微形态学观察
• 2.3.3 细胞形状变化几何参数分析
• 2.3.4 细胞运动迁移行为表征
• 2.3.5 细胞E 钙粘素检测
• 2.3.6 细胞增殖检测
• 2.4 结果及分析
• 2.4.1 不同生长密度对肝癌细胞和肝细胞E 钙粘素分布和表达影响
• 2.4.2 不同生长密度细胞运动和形变能力比较
• 2.4.3 不同生长密度对细胞生长状态影响
• 2.5 讨论
• 2.5.1 肝细胞生长密度与其细胞间 E 钙粘素分布密度呈正相关，并与其运动变形能力和生长增殖能力呈负相关
• 2.5.2 肝癌细胞生长密度对其细胞间 E 钙粘素分布密度有一定影响，但对细胞运动变形能力和生长增殖影响不明显（表达高、分布散）
• 3 肝癌细胞基底拉伸和收缩对其生长增殖的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料、试剂和仪器设备
• 3.2.1 实验仪器与设备同2.2.1
• 3.2.2 实验材料同2.2.2
• 3.2.3 主要试剂的配制同2.2.2
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 显微形态学观察同2.3.1
• 3.3.2 细胞运动性表征同2.3.2
• 3.3.3 细胞周期的测定
• 3.3.4 机械拉伸和收缩装置
• 3.4 结果和分析
• 3.4.1 拉伸和收缩10%对肝癌细胞形态影响
• 3.4.2 拉伸和收缩10%对肝癌细胞增殖和凋亡影响
• 3.4.3 拉伸和收缩30%对肝癌细胞形态影响
• 3.4.4 拉伸和收缩30%对肝癌细胞增殖和凋亡的影响
• 3.5 讨论
• 3.5.1 正常细胞LO2 生长群落“空洞”现象
• 3.5.2 肝癌细胞生长群落圆细胞堆砌现象
• 3.5.3 细胞骨架预应力成为新的研究视角
• 4 结论及展望
• 4.1 全文主要研究工作及主要结论
• 4.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间发表论文情况
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目情况