食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金免疫快速检测技术研究

论文摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是单端孢霉烯族毒素之一,广泛存在于谷物和饲料中,严重危害人类和动物的健康。目前的检测方法操作繁琐,大多需要专门的仪器进行配套检测,无法满足快速、简便、现场检测的要求。本文以多克隆抗体和胶体金合成标记技术为基础,根据免疫层析的原理,建立了食品中DON胶体金免疫快速检测方法。通过DCC法合成DON完全抗原,DON与BSA的初始摩尔比为50:1,得到DON完全抗原中DON与BSA的摩尔比为9.7:1。通过红外光谱扫描以及ELISA实验验证了DON-BSA的偶联成功。将DON-BSA免疫新西兰大白兔,得到抗体的最高效价为12800,抑制率IC50为10μg/mL,与T-2毒素、NIV的交叉反应率分别为9.1%,4.9%。采用柠檬酸三钠还原法成功制备了粒径为10 nm和20 nm的胶体金,并在紫外图谱上进行了表征。胶体金标记抗体的最适pH为9.0,最适抗体加入量为0.066 mg/mL、0.072 mg/mL。胶体金标记抗血清得到免疫胶体金探针,胶体金、抗体溶液、免疫探针复合物做紫外扫描,280 nm附近有蛋白特征峰出现,与胶体金复合后,原出现在520 nm处的胶体金的特征峰,峰值增高,并平移至540 nm附近,证明大分子蛋白抗体与胶体金偶联成功。标记前后的抗体蛋白红外光谱扫描的结果表明,标记前后抗体蛋白的特征基团结构没有发生明显的变化。对抗体探针进行荧光光谱扫描分析,胶体金对抗体蛋白的内源荧光有猝灭作用,并且随着胶体金浓度的增加,抗体的荧光强度呈现有规律的降低,发射光的位置不变。以胶体金标记多克隆抗体作为探针,DON-BSA作为竞争抗原,构建了胶体金免疫检测体系（GICA）。确定最佳包被抗原浓度为10μg/mL,缓冲液体系:10%甲醇+0.05%吐温20的pH 7.4 PBS溶液,胶体金的最佳粒径20 nm左右。GICA目测检出限为1 mg/kg,检测时间为1015 min。方法的重复性良好。方法的稳定性良好,试纸条室温保存3个月,4℃保存6个月。对自然污染的样品进行ELISA和GICA检测,结果证明两者有良好的一致性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇简介
• 1.1.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的发现、命名及其结构
• 1.1.2 DON 的理化性质
• 1.2 DON 的毒性及其作用机理
• 1.2.1 DON 的致呕吐作用
• 1.2.2 DON 的急性毒性
• 1.2.3 DON 的慢性毒性
• 1.2.4 DON 的细胞毒性
• 1.2.5 DON 的皮肤毒性
• 1.2.6 DON 的遗传毒性
• 1.2.7 DON 的免疫毒性
• 1.2.8 DON 的三致（致癌、致畸、致突变）作用
• 1.3 DON 的污染情况
• 1.4 DON 的检测
• 1.4.1 薄层色谱法（TLC）
• 1.4.2 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.4.3 气相色谱法（GC）
• 1.4.4 酶联免疫吸附测定法
• 1.4.5 目前的各种检测方法的比较
• 1.5 胶体金免疫检测技术研究进展
• 1.5.1 胶体金简介
• 1.5.2 纳米金溶胶免疫技术的兴起
• 1.5.3 纳米金溶胶合成及标记技术的简介
• 1.6 本课题的意义及主要研究内容
• 1.6.1 立题背景及意义
• 1.6.2 论文主要研究内容
• 第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全抗原的制备与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 MBSA（modified bovine serum albumen）的制备
• 2.3.2 DON 的衍生化
• 2.3.3 LC/MS 鉴定DON 衍生物
• 2.3.4 DON 完全抗原的构建（免疫抗原）
• 2.3.5 红外光谱鉴定完全抗原结构
• 2.3.6 偶联比的测定
• 2.3.7 抗呕吐毒素抗体效价测定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 DON 的衍生化
• 2.4.2 DON 完全抗原的结构鉴定
• 2.4.3 偶联比的计算
• 2.4.4 抗血清效价的确定
• 2.5 讨论
• 2.6 本章小结
• 第三章 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的制备与鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 材料和试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.2.3 主要溶液
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 抗血清的制备
• 3.3.2 抗血清的分离与保存
• 3.3.3 抗血清的纯化
• 3.3.4 最佳包被浓度以及抗体稀释度的确定
• 3.3.5 抗呕吐毒素抗体效价的测定
• 3.3.6 抑制浓度IC50 的测定
• 3.3.7 交叉反应率的测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 抗原最佳包被浓度和抗体最佳工作浓度的确定
• 3.4.2 抗血清效价的确定
• 3.4.3 抑制率IC50 以及交叉反应率
• 3.5 讨论
• 3.6 本章主要结论
• 第四章 抗体金标探针的制备以及检测方法的建立
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 胶体金的合成原理
• 4.3.2 胶体金的合成
• 4.3.3 胶体金标记DON 抗体最适条件的确定
• 4.3.4 金标多克隆抗体的制备与纯化
• 4.3.5 金标抗体复合物紫外分析
• 4.3.6 金标探针红外光谱分析
• 4.3.7 胶体金与抗体相互作用的荧光光谱
• 4.3.8 检测体系构建原理
• 4.3.9 硝酸纤维素膜（ NC 膜）的确定
• 4.3.10 DON-BSA 包被稀释度的确定
• 4.3.11 羊抗兔二抗点样浓度的确定
• 4.3.12 胶体金粒径对检测体系的影响
• 4.3.13 样品缓冲液体系
• 4.3.14 显色时间测定
• 4.3.15 检测重现性
• 4.3.16 稳定性试验
• 4.4 讨论
• 4.5 本章主要结论
• 第五章 胶体金免疫检测方法的应用及其与ELISA 和HPLC 的比较
• 5.1 引言
• 5.2 实验原料与方法
• 5.2.1 原料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 高效液相色谱法
• 5.3.2 酶联免疫检测方法
• 5.3.3 胶体金免疫检测方法
• 5.4 胶体金免疫检测和ELISA 检测的相关性
• 5.5 讨论
• 5.6 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 攻读硕士期间发表的文章