论文摘要
中国荷斯坦牛最适宜的环境温度为5-20℃。由于我国夏季高温可达35℃以上,且持续时间较长,中国荷斯坦牛在夏季经历的强烈持久的热应激会引发的机体热损伤,甚至多器官功能障碍综合征,严重影响其生产和繁殖性能,并使其免疫力大大降低,因此热应激已经成为限制奶业发展的重要因素之一。趋化因子配体3（Chemokine ligand3,CCL3）是臼趋化因子亚家族（CC趋化因子亚家族）中重要成员之一,在红系祖细胞、巨核细胞集落的形成和炎症细胞的趋化募集过程中发挥重要作用；与多发性骨髓瘤、人类免疫缺陷病毒感染、急性冠脉综合征、哮喘等疾病的发生密切相关。CCL3基因的发现为疾病的诊断、预防和治疗提供新靶点,也为动物的抗逆育种提供了新思路。目前还未有关于CCL3在热应激过程中的生物学功能的相关报道,但本课题组前期研究显示,中国荷斯坦牛外周全血经42℃热激1h和4h后,CCL3表达出现明显上调。因此我们将其作为与奶牛耐热性相关的候选功能基因筛查该基因内的SNPs,以期为动物的抗逆育种提供新思路。本试验首先克隆了奶牛CCL3基因的DNA序列,并在群体范围内进行了聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP）分析,以全面筛查CCL3基因内的SNPs。通过进行CCL3基因SNPs与其血常规、血清生化指标等的关联分析,对其SNPs进行分子解析、精细评价。1.热应激对中国荷斯坦牛直肠温度、血常规、血清生化指标的影响非热应激期（15℃）中国荷斯坦牛直肠温度极显著低于热应激临界期（26℃）（P<0.01）和热应激期（37℃）（P<0.01）。非热应激期（15℃）中国荷斯坦牛外周血的淋巴细胞数量、单核细胞数量、单核细胞百分含量、淋巴细胞百分比极显著高于热应激临界期（26℃）（P<0.01）和热应激期（37℃）（P<0.01）；非热应激期（15℃）中国荷斯坦牛外周血的白细胞计数、中性粒细胞数量、嗜酸性细胞数量、嗜碱性细胞数量、中性粒细胞百分比、嗜酸细胞百分含量、嗜碱细胞百分含量、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、红细胞体积分布宽度均极显著低于热应激临界期（26℃）（P<0.01）和热应激期（37℃）（P<0.01）,其中热应激临界期（26℃）平均血红蛋白含量显著低于热应激期（37℃）（P<0.05）,热应激临界期（26℃）平均血红蛋白浓度极显著低于热应激期（37℃）（P<0.01）。非热应激期（15℃）中国荷斯坦牛外周血血清中丙二醛极显著低于热应激临界期（26℃）（P<0.01）和热应激期（37℃）（P<0.01）,且热应激临界期（26℃）丙二醛也极显著低于热应激期（37℃）（P<0.01）。非热应激期（15℃）中国荷斯坦牛外周血血清中碱性磷酸酶极显著高于热应激临界期（26℃）（P<0.01）和热应激期（37℃）（P<0.01）。热应激期（37℃）中国荷斯坦牛外周血血清中碱性磷酸酶虽较热应激临界期（26℃）有所降低,但二者间差异不显著（P>0.05）。非热应激期（15℃）中国荷斯坦牛外周血总抗氧化能力极显著高于热应激临界期（26℃）（P<0.01）和非热应激期（37℃）（P<0.01）,且热应激临界期（26℃）中国荷斯坦牛外周血血清总抗氧化能力显著高于热应激期（37℃）（P<0.05）。2.中国荷斯坦牛CCL3基因DNA序列的克隆及其生物信息学分析本试验根据实验室克隆的CCL3基因的cDNA序列,设计了1对用于奶牛CCL3基因克隆的引物,最终获得全度为1874bp的奶牛CCL3基因序列,该序列包括3个外显子（1-89bp、945-1061bp和1364～1874bp）和2个内含子（90～944bp和1062～1363bp）,其基因结构与其他哺乳动物CCL3基因结构一致。此外,CCL3基因的多物种比对结果显示,中国荷斯坦牛CCL3基因DNA序列与欧洲牛的同源性最高,为92.77%,与人和黑猩猩的分别为53.66%和53.52%。3.中国荷斯坦牛CCL3基因PCR-SSCP检测及其多态性分析试验采用PCR-SSCP的方法对所克隆的中国和斯坦牛CCL3基因的序列进行了SNPs检测。试验设计的-6对引物,其中P2和P6引物对检测到多态,测序结果显示在512（C→T）、560（C→A）、562（C-→T）、1512（T→C）和1793（A→G）这5个位点发生了突变。使用Haploview4.0软件对CCL3基因进行了连锁不平衡分析；通过对D值95%可信区间上下限的分析,在CCL3基因范围内构建了2个单倍域（Haplotype block）,分别为512位、560位和562位SNP所代表的序列形成单倍域1,与1512位和1793位的SNP所代表的序列形成单倍域2。根据单倍域内SNPs之间的r2值挑选了2个htSNPs（512C→T和1512T→C）。其中htSNP512属于低度多态（PIC<0.25）,htSNP1512属于中度多态性（0.25<PIC<0.5）。χ2适合性检验结果表明,CCL3基因的两个htSNPs均显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）。4.中国荷斯坦牛CCL3基因多态性与直肠温度、血常规等的关联分析htSNP512可显著影响中国荷斯坦牛热应激期的直肠温度和平均红细胞体积（P<0.05）,且CT个体的直肠温度显著高于CC个体（P<0.05）,而CT个体的平均红细胞体积显著低于CC个体（P<0.05）。htSNP1512可显著影响中国荷斯坦牛热应激期淋巴细胞数量和淋巴细胞百分含量（P<0.05）,TC个体的淋巴细胞数量和淋巴细胞百分含量显著高于TT个体（P<0.05）。
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