论文摘要
变形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）336X菌株能抑制由子囊菌禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var. tritici, Ggt）侵染根部所引起的小麦全蚀病（take-allof wheat）,具有开发成生防制剂的潜力。从分子水平上探索336X的生防机制,研究生防细菌与植物之间的相互作用,具有重要的理论和现实意义。在本研究中,用变形斑沙雷氏菌568菌株基因组中一个预测的ABC转运系统相关基因设计引物phyF/R,以336X基因组DNA作为模板,通过PCR扩增出全长1569bp的完整ORF片段。扩增片段用载体pMD-18T克隆,经过测序分析,发现该片段和568菌株预测的4’-phytase同源,同源性指数为94%,故将该基因命名为phy。保守域序列分析表明,预测氨基酸序列和周质可溶性结合蛋白家族Ⅱ（PBP2NikADppAOppAlike7）同源,相似性达15-21%。通过信号肽预测程序SignalP 3.0 Server分析,发现在N端有一段31个氨基酸的信号肽序列,成熟肽链可能在27-28位氨基酸处切开。为了研究phy的功能,将phy片段插入自杀性载体pKAS32,并用卡那霉素抗性片段中断,构建同源双交换敲除载体pKAS2-phy-km。通过接合作用将该质粒从大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli） S17-1导入336X中,PCR检测得到3株Phy缺陷型突变株。通过一系列的表型实验,发现突变株摄取Ni2+的能力下降,表明Phy可能编码Ni2+运输过程中的Ni2+。结合蛋白组分。同时发现突变株的生防能力下降,对小麦根部分泌物的应答减弱,在小麦根表的定殖数量减少。这些结果可能有助于我们分析336X的生防机制。为了进一步研究Phy性质,将Phy的ORF序列插入pET-30a中构建异源表达载体pET30a-phy,将该载体导入到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。结果发现经过异丙基-p-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导,一个约60 kD的重组蛋白得以表达。对诱导条件进行了优化,发现最适的条件为：0.5 mmol/L IPTG于28℃下诱导5 h。表达的包涵体蛋白通过超声破碎、6 mol/L盐酸胍溶解后,变性条件下用Ni2+-NTA亲和柱纯化,及梯度复性得到可溶性蛋白。本研究为蛋白的序列分析,结构鉴定及活性部位研究等奠定了基础。