超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii RadA同源蛋白的生化性质鉴定

论文摘要

同源重组是生物中普遍存在的DNA修复途径,它对于修复DNA断裂、维持基因组稳定性、重启复制叉以及真核生物的减数分裂都具有重要作用。目前对于古菌同源重组的研究还仅处于初级阶段,然而却发现了相似于真核生物同源重组机制中的蛋白:重组早期处理断裂双链的蛋白Mrell和Rad50;在广古菌中存在的单链结合蛋白RPA;古菌中的重组酶（recombinase）RadA,它与真核生物中的Rad51具有约40%的同源性,与RecA仅有约20%的同源性;相似于真核生物中存在Rad51的同源蛋白,在广古菌中也存在RadA的同源蛋白。RecA/Rad51/RadA是三域生物中同源重组的关键蛋白,在同源重组中促进链交换形成Holliday junction结构。在细菌及真核生物中许多蛋白参与介导RecA/Rad51形成核蛋白丝或帮助其进行链交换,如细菌中的RecBCD、RecFOR复合体,真核生物中的Rad52、Rad54、Rad55和Rad57等。在真核生物中存在Rad51的同源蛋白包括酵母中的Rad55/Rad57复合体、高等真核生物中的Rad51B-Rad51C-Rad51D-XRCC2和Rad51C-XRCC3复合体。遗传分析表明它们参与了同源重组,其中Rad55/Rad57已被鉴定稳定Rad51核蛋白丝的结构。在广古菌中也存在RadA的同源蛋白RadB。然而,目前还没有对泉古菌中RadA同源蛋白的报道。我们通过序列分析,在嗜热泉古菌Sulfolobus tokodaii Str.7基因组中找到四个RadA的同源蛋白,系统发育分析表明它们更加相似于真核生物中的Rad55,因而我们把它们命名为stRad55A（ST0579）,stRad55B（ST0838）,stRad55C（ST1830）和stRad55D（ST2522）。运用RT-PCR分析了S.tokodaii radA、rad55A、rad55B、rad55C及rad55D基因转录受紫外线照射的诱导性,发现radA、rad55A和rad55B的基因转录是受紫外线诱导的,表明这些蛋白可能参与DNA修复。在E.coli中表达了这些蛋白及S.tokodaii单链结合蛋白SSB,其中RadA、stRad55A、stRad55C和SSB在E.coli表达菌中能够以可溶的形式表达,stRad55B和stRad55D以包涵体的形式表达。分子筛层析结果表明RadA、stRad55A和stRad55C在溶液中分别以寡聚体的形式存在,SSB以单体的形式存在。进一步对stRad55A、stRad55B和stRad55C进行了生化性质鉴定,发现（1）stRad55A具有很多相似于Rad52的性质:相对于双链DNA（dsDNA）,对单链DNA（ssDNA）具有更大的亲和性;具有ssDNA依赖的ATPase活性;可以解除SSB对RadA链交换活性的影响;可以介导RadA结合至SSB覆盖的ssDNA链;与RadA和SSB都有相互作用。然而,也有与Rad52不同的性质:在没有SSB的链交换反应体系中抑制RadA的活性;没有检测到它对DNA的退火活性。（2）通过stRad55B与RadA的共表达,得到了stRad55B蛋白的可溶性形式并纯化了stRad55B蛋白,说明stRad55B与RadA具有相互作用,可以形成复合体;相对于dsDNA,stRad55B对ssDNA具有更大的亲和性;具有不依赖于DNA的较弱的ATPase活性;在没有SSB的链交换反应体系中抑制RadA的活性。目前所得到的生化性质数据显示stRad55B的性质更加相似于RadB。（3）stRad55C与stRad55A相同,更易结合ssDNA,具有ssDNA依赖的ATPase活性;stRad55C与S.tokodaii中的RadA和Hjc具有相互作用;在没有SSB的链交换反应体系中抑制RadA的活性;促进Hjc切割Holliday junction的活性。我们对S.tokodaii的研究是首次对泉古菌中RadA同源蛋白进行鉴定。目前所得到的数据并不能完全阐释蛋白在细胞内的具体作用,但一些生化性质鉴定以及蛋白相互作用检测结果证实这些蛋白参与了DNA修复。蛋白在细胞内的具体作用机制需要更多的生化性质鉴定及遗传分析。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 生物界分类、超嗜热古菌及Sulfolobus tokodaii Str.7简介
• 1.1.1 生物界分类
• 1.1.2 极端嗜热古菌及其主要类群
• 1.1.3 S.tokodaii Str.7简介
• 1.2 同源重组在细胞中的作用及研究古菌同源重组修复的意义
• 1.2.1 同源重组的过程及其在细胞中的重要作用
• 1.2.2 研究古菌同源重组修复的意义
• 1.3 同源重组中的重组酶
• 1.3.1 重组酶RecA、Rad51和RadA
• 1.3.2 真核生物特有的重组酶-Dmc1
• 1.4 单链结合蛋白及其在同源重组中的作用
• 1.5 细菌及真核生物中的同源重组"辅助"蛋白
• 1.5.1 细菌中的同源重组"辅助"蛋白
• 1.5.2 真核生物中的同源重组"辅助"蛋白
• 1.6 广古菌中RadA的同源蛋白-RadB
• 1.7 古菌特有的Holliday junction切割蛋白Hjc
• 1.8 本试验的立题依据
• 第二章 Sulfolobus tokodaii RadA及RadA同源物基因的UV诱导性分析
• 引言
• 2.1 实验材料、试剂及实验仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法和步骤
• 2.2.1 S.tokodaii Str.7紫外线（UV）抗性分析
• 2.2.2 RT-PCR分析基因转录的紫外线（UV）诱导性
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 S.tokodaii Str.7紫外线（UV）抗性分析
• 2.3.2 RT-PCR分析经UV照射后基因转录情况
• 2.4 小结
• 第三章 Sulfolobus tokodaii RadA、RadA同源蛋白和SSB的表达、纯化及寡聚体性质分析
• 引言
• 3.1 实验材料、试剂和实验仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法和步骤
• 3.2.1 蛋白的表达
• 3.2.2 目的蛋白的纯化
• 3.2.3 分子筛层析分析蛋白的寡聚体性质
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 蛋白的表达、纯化
• 3.3.2 蛋白的寡聚体性质分析
• 3.4 小结
• 第四章 stRad55A的生化性质鉴定
• 引言
• 4.1 实验材料、试剂和仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法和步骤
• 4.2.1 Western blotting分析rad55A基因表达的诱导性
• 4.2.2 DNA结合实验
• 4.2.3 ATPase活性检测
• 4.2.4 链交换实验
• 4.2.5 蛋白对固定在Sepharose 4B的ssDNA的结合实验
• 4.2.6 Pull down实验检测蛋白间相互作用
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 Western blotting分析rad55A基因表达的诱导性
• 4.3.2 stRad55A的DNA结合活性
• 4.3.3 stRad55A的ATPase活性
• 4.3.4 stRad55A对RadA链交换活性的影响
• 4.3.5 stRad55A可以帮助RadA结合在SSB饱和的ssDNA
• 4.3.6 stRad55A与RadA、SSB都具有相互作用
• 4.4 小结
• 第五章 stRad55B的生化性质鉴定
• 引言
• 5.1 实验材料、试剂和仪器
• 5.2 实验方法和步骤
• 5.2.1 stRad55B与RadA共表达菌株的构建
• 5.2.2 stRad55B的表达纯化
• 5.2.3 纯化的stRad55B的热稳定性检测
• 5.2.4 DNA结合活性检测
• 5.2.5 ATPase活性检测
• 5.2.6 链交换实验
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 stRad55B的表达纯化
• 5.3.2 stRad55B的热稳定性
• 5.3.3 stRad55B的DNA结合活性
• 5.3.4 stRad55B的ATPase活性
• 5.3.5 stRad55B对RadA链交换活性的影响
• 5.4 小结
• 第六章 stRad55C的生化性质鉴定
• 引言
• 6.1 实验材料、试剂和仪器
• 6.2 实验方法和步骤
• 6.2.1 Pull down实验检测蛋白的相互作用
• 6.2.2 DNA结合活性检测
• 6.2.3 ATPase活性检测
• 6.2.4 链交换实验
• 6.2.5 Holliday junction切割实验
• 6.3 结果和讨论
• 6.3.1 stRad55C与RadA、Hic具有相互作用
• 6.3.2 stRad55C的DNA结合活性
• 6.3.3 stRad55C的ATPase活性
• 6.3.4 stRad55C抑制RadA的链结合活性
• 6.3.5 stRad55C促进Hjc切割Holliday junction的活性
• 6.4 小结
• 第七章 总结与展望
• 附录1 本文所使用的主要实验仪器及试剂
• 附录2 本文构建重组质粒所使用的引物
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的文章
• 学位论文评阅及答辩情况表