小鼠胚胎干细胞分化为肝祖细胞的研究及机制探讨

论文摘要

我国为病毒性肝炎的高发区,由病毒性肝炎导致的重型肝炎死亡率可达50%-70%。目前对于重症肝功能衰竭的患者的治疗方案主要为整体肝脏移植,但是供体肝的来源有限,使得许多需要肝移植的患者得不到及时救治。肝细胞移植是治疗终末期肝病较有希望的技术之一。1988年Bumgardner等率先提出了肝细胞移植概念,直至1993年,才由Mito等开展了世界首例人体肝细胞移植技术（自体同源性肝细胞移植）,随后肝细胞移植技术的研究工作快速发展,并成为生物医学研究的热点领域之一,而肝细胞移植研究的关键是肝细胞的来源问题。临床研究表明,自体成熟的肝细胞最适合临床移植。然而,应用自体成熟肝细胞的主要限制因素是病状情况下肝脏不能产生大量的正常肝功能细胞,也不能保持肝细胞补充的恒定需要,因此,人们首先想到了胚胎干细胞。ES细胞具有自我更新、多向分化、无限增殖等全能干细胞特性,可能是解决这一难题的希望所在,它可以通过细胞分裂维持自身细胞群体的大小,同时又可以进一步分化成为不同组织的细胞。所以,ES细胞有望成为人工肝脏和肝细胞移植治疗的种子细胞新来源,从而应用于组织构建和细胞治疗当中,如果这些肝细胞移植手段已经技术成熟,并细胞来源充足的话,会使生物工程中的肝细胞移植治疗和人工肝组织器官移植有可能成为21世纪人类攻克肝脏疾病的根本治疗措施。2002年,Chinzei实验室利用ES细胞可以自发分化形成拟胚体这一方法,分化得到类肝细胞,并将分化的细胞移植于肝损伤小鼠中,4周后发现分化的细胞可以整合入受体肝脏中。同年,Yamada等也报道了相似的研究成果。在随后几年中,胚胎干细胞向肝细胞分化的研究迅速发展,模拟体内胚胎肝脏发育的过程和机制,在诱导分化的过程中,分步骤加入了生长因子等诱导剂,以期得到高效率的肝细胞。而且,这种分化ES细胞为肝细胞的探索也为胎肝发生及形成的机制研究提供一个很好的体外研究平台。本研究采用小鼠胚胎干细胞E14.1细胞系,利用无滋养层培养方法传代培养,将带有抗性基因筛选的质粒:Alb启动子调控的红色荧光蛋白（mRFP）,CK19启动子调控的绿色荧光蛋白（EGFP）同时稳定转染ES细胞,建立遗传修饰ES细胞系E14.1-1;Alb启动子调控的绿色荧光蛋白（EGFP）,CK19启动子调控的hCD25和红色荧光蛋白（tdTOMATO）稳定转染ES细胞,建立E14.1-2细胞系。在体外,对E14.1-1和E14.1-2细胞系同时进行了传统血清和无血清的诱导方法,比较两种方法产生内胚层细胞和肝祖细胞的区别,结果发现在血清诱导中,内胚层细胞和肝祖细胞的产生率很低,分别为14%和3%。在无血清培养条件下,采用两步诱导法分化产生肝祖细胞。遗传修饰后的胚胎干细胞E14.1-1和E14.1-2,首先悬浮培养形成EB,生长2天后,加入activin A继续诱导分化2天,根据定形内胚层（definitive endoderm,DE）细胞膜表面标志抗原为CXCR4、ECD、c-Kit,通过FACS分析,无论是CXCR4+/ECD+还是CXCR4+/c-Kit+细胞群,在诱导分化的第4天达到峰值75%;诱导后内胚层基因Foxa2、Sox17、Hex、Shh、Gata4、Gata6都开始表达,中胚层基因Flk1、Mixl1也有表达,但是没有检测到神经外胚层基因Pax6的表达;分选CXCR4+/c-Kit+细胞群,内胚层基因Foxa2、Sox17、Hex都在CXCR4+/c-Kit+细胞群内表达,而且不表达脏壁内胚层（visceral endoderm,VE）的基因Sox7,说明通过此方法诱导后,分选得到的CXCR4+/c-Kit+细胞群为定形内胚层细胞。分选定形内胚层细胞,比较悬浮培养和贴壁培养对肝祖细胞分化的影响。悬浮培养:将细胞悬浮培养在低贴附培养皿中,令其形成球状克隆,培养基中加入bFGF、BMP-4生长因子,诱导48小时后,可明显检测到有关肝分化的基因（Prox1、Afb、Hnf4、Ttr）上调,将球状克隆贴附于Ⅰ型胶原上,加入HGF、EGF继续培养;单层贴壁培养:将细胞贴于铺有Ⅰ型胶原的培养皿中继续培养,培养基与单层培养方法一致;在培养12天时,可在球状克隆中检测到ALB和CK19双阳性的细胞,FACS分析ALB+/CK19+细胞比例为22%,而单层培养中并未看到ALB和CK19的表达。RT-PCR检测表明,球状克隆生长的内胚层细胞分化程度要早于单层贴壁培养的内胚层细胞。利用体外ES细胞经内胚层分化为肝祖细胞的发育模式,研究Gata4和Gata6在肝脏形成中的作用。采用RNA干扰的方法,建立稳定RNAi的ES细胞系,通过Q-PCR检测到,在向内胚层分化过程中,Gata4和Gata6并没有影响到DE基因Tm4sf2和Cxcr4的表达,然而却影响到了VE基因Emp2和Amn的表达;同时抑制Gata4和Gata6表达后,肝祖细胞发育相关的基因Afp、Hnf4、Ttr的表达均被降低,但单独抑制一个因子则没有很明显的变化,说明在肝祖细胞分化过程中,Gata4和Gata6起到重要作用,并在功能上相互补偿。本实验研究首次遵循胚胎肝脏发育过程,采用从胚胎干细胞经内胚层分化为肝祖细胞的方法,明确地产生同一发育阶段的肝祖细胞,为胚胎干细胞在体外研究胎肝发育模式和细胞治疗领域提供了一个简便的途径;首次在小鼠中证明了Gata4和Gata6在肝发育中具有互补功能,共同作用于胎肝形成及发育,探索了胚胎肝脏发育的机制,为进一步有效分化ES细胞提供了理论基础和实验数据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 前言
• 一、小鼠胚胎肝脏发育分子机制
• 二、胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展
• 三、本课题研究的目的和意义
• 实验材料
• 一、主要器材和设备
• 二、主要试剂及其制备
• 实验方法
• 一、双启动子调控报告基因载体的构建和遗传修饰胚胎干细胞系的建立
• 二、分化ES细胞为内胚层细胞
• 三、诱导内胚层细胞为肝祖细胞
• 四、构建慢病毒 RNA干扰载体及遗传修饰胚胎干细胞系
• 实验结果
• 一、肝祖细胞特异启动子载体的构建及胚胎干细胞系的建立
• 二、小鼠胚胎干细胞向内胚层细胞分化
• 三、诱导遗传修饰的胚胎干细胞E14.1-1和E14.1-2向肝脏细胞分化
• 四、无血清诱导分化系统的机制探讨
• 讨论
• 一、建立遗传修饰小鼠胚胎干细胞
• 二、胚胎干细胞可以通过两步法分化得到肝祖细胞
• 三、体外诱导ES细胞分化为肝祖细胞过程中的问题
• 四、Gata4和Gata6转录因子影响肝分化进程
• 附录
• 参考文献
• 综述：胚胎干细胞治疗肝脏疾病的探索
• 致谢