ATP生物发光法检测食品细菌总数试剂盒的研究

论文摘要

ATP生物发光法具有反应快速、操作简便等优点,已应用于食品细菌总数检测。但是该法存在灵敏度不高、试剂不耐储存导致测定结果不稳定等缺点,使其在食品安全、医疗卫生、环境监控等领域中的应用受到限制。针对上述缺点,本文通过单因素试验、双因素优选试验优化了ATP生物发光反应条件,建立了ATP生物发光检测新技术。根据萤火虫荧光素酶的结构特点和性质,对ATP生物发光反应中酶的稳定性进行研究,研制出新型酶保护剂,提高了ATP生物发光检测技术的稳定性和灵敏度。在提取剂的筛选、提取剂浓度及提取时间的确定过程中,将ATP生物发光法和平板计数法进行协同研究,得出了一致的结论。将优化的ATP生物发光法应用于各类食品（液体、固体、熟食、生鲜品）中细菌总数的检测,确定了该方法在食品中应用的可行性。主要研究结果如下:（1）ATP生物发光反应条件的优化:确定了FL浓度为53mg/L、Ln浓度为80mg/L为最佳的酶与底物浓度组合,Mg2+的最适作用浓度为0.25mM,反应体系最优化pH值为7.2,温度为23℃。（2）萤火虫荧光素酶稳定性研究:确定了BSA、酪蛋白钠盐、正辛酸钠与Tris缓冲液的组合剂在一定程度上能提高酶的稳定性和检测方法的灵敏性,实现了荧光素酶由只能在冷冻条件下保存转至可在25℃保存的变化,且4℃下保存时间可延至7d,酶活保存率高达85.99%。（3）ATP提取方法研究:通过对细胞内多种ATP提取剂的筛选研究,确定了CTAB为最佳的细菌细胞ATP提取剂。CTAB的最适作用浓度为0.015%,最佳提取时间为3min,提取过程中添加0.25%的β-CD有助于提高ATP生物发光法的准确性和灵敏度。（4）方法的考核:优化的方法检出限高达单个细菌,批内变异和批间变异分别小于7%和8%,重现性分析RSD为4.0%,ATP加标回收率范围为82.2%112.4%,表明建立的ATP生物发光法准确可靠。将优化的ATP生物发光法应用于苹果汁、面粉、熟肉制品、鱼肉中细菌总数的检测,同时与平板计数法测定结果比较具有良好的相关性（ R2> 0.96）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 食品中细菌总数检测技术的研究现状
• 1.2 ATP 生物发光法的研究概述
• 1.2.1 ATP 的理化性质
• 1.2.2 国内外研究概况
• 1.2.3 ATP 生物发光法的原理
• 1.2.4 ATP 生物发光法的特点
• 1.2.5 ATP 生物发光法的应用
• 1.3 研究目的及意义
• 1.4 研究主要内容
• 第2章 ATP 生物发光检测方法的建立
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ATP 生物发光反应条件的优化
• 2.2.2 ATP 生物发光反应影响因素的研究
• 2.2.3 ATP 生物发光法标准曲线的制备
• 2.2.4 最低检测限的确定
• 2.2.5 方法的精密度
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 反应体系条件的优化
• 2.3.2 反应影响因素研究
• 2.3.3 标准曲线的绘制
• 2.3.4 最低检测限的确定
• 2.3.5 方法的精密度
• 2.4 结论
• 第3章 ATP 生物发光法中萤火虫荧光素酶稳定性研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶稳定剂对发光反应的影响
• 3.2.2 酶保存溶液的选择
• 3.2.3 酶保存温度的选择
• 3.2.4 酶保存时间的确定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 酶稳定剂对发光反应的影响
• 3.3.2 酶保存溶液的选择
• 3.3.3 酶保存温度的选择
• 3.3.4 酶保存时间的确定
• 3.4 结论
• 第4章 ATP 生物发光法中 ATP 提取方法的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 主要试剂及菌株
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 菌悬液制备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 ATP 提取剂的筛选
• 4.2.2 ATP 提取条件的优化
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 ATP 提取剂的确定
• 4.3.2 ATP 提取条件的确定
• 4.4 结论
• 第5章 ATP 生物发光法在食品细菌总数检验上的应用
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 主要试剂及原料
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 样品制备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 ATP 生物发光法工作曲线
• 5.2.2 苹果汁中细菌总数的检测方法
• 5.2.3 面粉中细菌总数的检测方法
• 5.2.4 熟食中细菌总数的检测方法
• 5.2.5 鱼肉中细菌总数的检测方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 ATP 生物发光法工作曲线
• 5.3.2 苹果汁中细菌总数的检测
• 5.3.3 面粉中细菌总数的检测
• 5.3.4 熟食中细菌总数的检测
• 5.3.5 鱼肉中细菌总数的检测
• 5.4 结论
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 研究特色
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果