木材蓝变生物控制菌康氏木霉几丁质酶的纯化与克隆

论文摘要

本研究是以康氏木霉为供试菌株（6111-ET）进行几丁质酶纯化、特性的研究,并对康氏木霉几丁质酶基因进行克隆、测序和初步的生物信息学分析,为探明其抑制木材蓝变菌的作用机制,工业化生产几丁质酶制成生物制剂,应用于木材蓝变色生物控制提供科学依据。康氏木霉（Trichoderma koningii）在液态PDA培养基中置于恒温摇床（200r/min,28℃）上培养10d,诱导产生几丁质酶。培养滤液通过硫酸铵分级沉淀,Q-HP强阴离子交换柱层析、Phenyl-Sepharose疏水层析、CM-Sepharose弱阳离子交换柱层析、Phenyl-Sepharose疏水柱层析,从康氏木霉培养的上清液中分离纯化了几丁质酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度分析表明,纯化后的几丁质酶基本达到了均一的程度,该酶的分子量约为36kDa。本研究对康氏木霉的几丁质酶的基本性质进行了测定。结果表明:该酶最适反应温度为40℃,水解几丁质的最适pH范围为3～6之间。在热稳定性方面,分别在30℃和60℃下保温80min后仍然可以保持原有的酶活力,温度过60℃以后,相对酶活开始下降;该酶对高温有一定的抵抗力,随着温度的升高,酶活力仍保持在60%左右。不同的金属阳离子对该酶都有不同的影响,Ca2+、Fe2+对酶活力有比较明显的激活作用,其中Fe2+的作用最强;而K+、Na+、Cu2+则有明显的抑制作用。本研究利用改进CTAB法提取康氏木霉总DNA,根据已发表康氏木霉几丁质酶DNA同源序列设计出引物,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增得到几丁质酶基因片段,将其连接到pMD18-T克隆载体上,对大肠杆菌E.coliJM109进行转化。经PCR鉴定后对阳性克隆进行了序列测定,将结果同已发表木霉几丁质酶基因序列进行分析比对,发现其同源相似性达到90%以上。本研究对康氏木霉几丁质酶基因进行克隆、测序和初步的生物信息学分析,为选择高产几丁质酶工程菌株和木霉几丁质酶规模化生产打下了必要的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 木材蓝变及研究现状
• 1.1.1 木材蓝变
• 1.1.2 木材蓝变生物防治的研究现状
• 1.1.3 展望
• 1.2 木霉
• 1.2.1 木霉简介
• 1.2.2 木霉菌生防作用
• 1.3 几丁质酶
• 1.3.1 几丁质简介
• 1.3.2 几丁质酶研究历史
• 1.3.3 微生物几丁质酶
• 1.3.4 几丁质酶的应用
• 1.3.5 几丁质酶基因克隆
• 1.3.6 几丁质酶应用前景
• 1.4 课题来源
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 康氏木霉几丁质酶的纯化及特性
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 常规试剂、溶液和缓冲液
• 2.1.4 其他材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 孢子培养
• 2.2.2 康氏木霉（T.koningii）胞外酶、胞内酶拮抗试验
• 2.2.3 康氏木霉（T.koningii）几丁质酶的纯化设计方案
• 2.2.4 康氏木霉（T.koningii）几丁质酶的基本性质
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 康氏木霉（T.koningii）胞外酶、胞内酶拮抗试验
• 2.3.2 蛋白酶K处理粗酶液实验
• 2.3.3 康氏木霉几丁质酶的纯化
• 2.3.4 康氏木霉几丁质酶的一般性质
• 2.4 结论与讨论
• 2.4.1 结论
• 2.4.2 讨论
• 第三章 康氏木霉几丁质酶基因克隆与序列分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基的制备
• 3.1.3 常规试剂,仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 康氏木霉菌株的扩繁
• 3.2.2 康氏木霉菌株总DNA的提取
• 3.2.3 PCR（多聚酶链式反应）基因扩增
• 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.5 DNA片段的克隆
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 康氏木霉菌株总DNA提取
• 3.3.2 PCR产物的获得和克隆
• 3.3.3 PCR产物的克隆与测序
• 3.3.4 序列分析及同源性初步判定
• 3.3.5 PCR产物同源相似性分析
• 3.4 结论与讨论
• 3.4.1 结论
• 3.4.2 讨论
• 第四章 研究总结
• 4.1 关于康氏木霉几丁质酶的纯化
• 4.2 关于康氏木霉几丁质酶基因克隆
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间所发表论文和取得的研究成果