本文主要研究内容
作者林翠（2019）在《猪圆环病毒2型ORF4蛋白诱导凋亡机制研究》一文中研究指出：猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus2,PCV2)是最小的哺乳动物病毒,也是仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。已有研究认为PCV2的致病性与多方面因素相关,其中病毒诱导凋亡是致病机制之一。ORF4作为与凋亡相关的病毒蛋白,其蛋白相关特性及其如何影响凋亡尚不明确。本研究通过观察ORF4的亚细胞定位、检测过表达ORF4或ORF4缺失突变体病毒对凋亡的影响以及寻找可能与ORF4相结合的细胞蛋白,旨在阐明ORF4潜在功能及其影响凋亡的机制。1.PCV2 ORF4蛋白潜在生物学特性研究虽然本实验室已通过Northern blot及间接免疫荧光试验(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)证实了 ORF4编码区及蛋白的存在,但仍然无法用免疫印迹(western blot,WB)检测到ORF4蛋白。对ORF4的生物学特性研究发现,细胞中瞬时表达的ORF4蛋白可被降解,加入蛋白酶体抑制剂MG132后降解速度减慢;ORF4稳转细胞系中只有在MG132存在的前提下,才能检测到ORF4蛋白的存在。这提示过表达的ORF4蛋白稳定性差,可通过蛋白酶体途径降解。ORF4的易降解特性同样也存在于病毒感染情况下,加入MG132后IFA检测的ORF4蛋白荧光数目显著增多。后续对检测方法的改善虽然仍无法用WB检测到病毒感染下ORF4蛋白,但也为ORF4的后续检测提供了参考数据。2.PCV2 ORF4蛋白亚细胞定位研究本研究利用CELLO v.2.5:subCELlular predictor等在线预测软件分析ORF4蛋白的亚细胞定位。随后,在PCV2感染及Flag-ORF4转染的细胞中,共聚焦观察。结果显示,瞬时转染细胞中ORF4与线粒体共定位,感染晚期ORF4在线粒体和胞核中均有分布。进一步研究过表达细胞系中ORF4蛋白定位,发现此时ORF4绝大部分弥散分布于胞核内。这提示ORF4蛋白具有线粒体与胞核双重定位特性。经软件分析ORF4蛋白序列中存在两个α-螺旋结构域,但不存在跨膜结构。根据预测所得的α-螺旋结构分布结果,构建一系列ORF4截短体分析出ORF4氨基端1-30aa呈点状分布于胞浆,与线粒体有共定位,该结果提示ORF4蛋白的氨基端包含24-30aa处α-螺旋的1-30aa氨基酸序列是其定位线粒体的关键区域。3.PCV2 0RF4蛋白功能分析为了分析ORF4蛋白功能,本研究将ORF4瞬时转染于293T、PK15及3D4/31三种细胞,检测总体凋亡指标,结果显示:caspase-3剪切体含量显著高于阴性对照。然而,在ORF4过表达细胞系中,无论是否加入MG132药物,caspase3切割量都没有明显改变。对瞬时表达ORF4激活的凋亡通路研究结果显示,在过表达ORF4细胞中,caspase9剪切体含量显著增多,胞浆中细胞色素c含量显著升高,但凋亡诱导因子AIF释放现象不明显。上述实验结果提示瞬时表达ORF4可诱导caspase依赖的线粒体凋亡。后续针对瞬时和稳定转染ORF4对凋亡激活的不同,揭示ORF4对凋亡的激活与其线粒体定位特性相关。随后,我们探索感染情况下ORF4在凋亡中所发挥的功能。利用本实验室保存wPCV2及ORF4缺失突变体病毒(m4PCV2)分别感染PK15细胞,72h后检测各项凋亡指标。结果显示,ORF4缺失毒感染细胞中,caspase3及caspase9剪切体含量、DNA片段化数目以及细胞色素c(cytc)释放量均显著降低,提示PCV2感染后可通过ORF4蛋白表达激活细胞内线粒体凋亡通路。综上所述,线粒体定位的ORF4蛋白可激活caspase依赖的线粒体凋亡。4.PCV2 ORF4蛋白诱导凋亡机制研究为了分析ORF4诱导线粒体凋亡机制,通过对ORF4与线粒体通透性转换孔径复合物蛋白腺嘌呤核苷酸转移酶III亚型(ANT3)及压力依赖性负离子通道I(VDAC1),细胞色素c氧化酶VIIIA亚基进行免疫共沉淀试验,结果显示ORF4只与ANT3发生特异性结合;3D-SIM分析后进一步确定了 ORF4与ANT3的相互结合。Co-IP及GST-Pull down试验寻找与ANT3互作的ORF4具体区域,结果显示ORF4的1-30aa不仅是ORF4的线粒体定位序列,同样也是与ANT3结合的关键结构域。通过RNAi的方法对细胞内源性ANT3蛋白表达进行干扰,发现在ANT3敲降的细胞系中,不仅ORF4过表达导致的裂解的caspase3含量减弱;同样PCV2诱导的caspase3、9裂解程度以及释放到胞浆中的细胞色素c的含量也由于ANT3的敲降而显著降低。上述数据表明ANT3在ORF4过表达及PCV2感染诱导的线粒体凋亡中发挥着关键作用。
Abstract
zhu yuan huan bing du 2xing (Porcine Circovirus2,PCV2)shi zui xiao de bu ru dong wu bing du ,ye shi zai zhu duo ji tong cui jie zeng ge zheng (PMWS)de zhu yao bing yuan 。yi you yan jiu ren wei PCV2de zhi bing xing yu duo fang mian yin su xiang guan ,ji zhong bing du you dao diao wang shi zhi bing ji zhi zhi yi 。ORF4zuo wei yu diao wang xiang guan de bing du dan bai ,ji dan bai xiang guan te xing ji ji ru he ying xiang diao wang shang bu ming que 。ben yan jiu tong guo guan cha ORF4de ya xi bao ding wei 、jian ce guo biao da ORF4huo ORF4que shi tu bian ti bing du dui diao wang de ying xiang yi ji xun zhao ke neng yu ORF4xiang jie ge de xi bao dan bai ,zhi zai chan ming ORF4qian zai gong neng ji ji ying xiang diao wang de ji zhi 。1.PCV2 ORF4dan bai qian zai sheng wu xue te xing yan jiu sui ran ben shi yan shi yi tong guo Northern blotji jian jie mian yi ying guang shi yan (Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)zheng shi le ORF4bian ma ou ji dan bai de cun zai ,dan reng ran mo fa yong mian yi yin ji (western blot,WB)jian ce dao ORF4dan bai 。dui ORF4de sheng wu xue te xing yan jiu fa xian ,xi bao zhong shun shi biao da de ORF4dan bai ke bei jiang jie ,jia ru dan bai mei ti yi zhi ji MG132hou jiang jie su du jian man ;ORF4wen zhuai xi bao ji zhong zhi you zai MG132cun zai de qian di xia ,cai neng jian ce dao ORF4dan bai de cun zai 。zhe di shi guo biao da de ORF4dan bai wen ding xing cha ,ke tong guo dan bai mei ti tu jing jiang jie 。ORF4de yi jiang jie te xing tong yang ye cun zai yu bing du gan ran qing kuang xia ,jia ru MG132hou IFAjian ce de ORF4dan bai ying guang shu mu xian zhe zeng duo 。hou xu dui jian ce fang fa de gai shan sui ran reng mo fa yong WBjian ce dao bing du gan ran xia ORF4dan bai ,dan ye wei ORF4de hou xu jian ce di gong le can kao shu ju 。2.PCV2 ORF4dan bai ya xi bao ding wei yan jiu ben yan jiu li yong CELLO v.2.5:subCELlular predictordeng zai xian yu ce ruan jian fen xi ORF4dan bai de ya xi bao ding wei 。sui hou ,zai PCV2gan ran ji Flag-ORF4zhuai ran de xi bao zhong ,gong ju jiao guan cha 。jie guo xian shi ,shun shi zhuai ran xi bao zhong ORF4yu xian li ti gong ding wei ,gan ran wan ji ORF4zai xian li ti he bao he zhong jun you fen bu 。jin yi bu yan jiu guo biao da xi bao ji zhong ORF4dan bai ding wei ,fa xian ci shi ORF4jue da bu fen mi san fen bu yu bao he nei 。zhe di shi ORF4dan bai ju you xian li ti yu bao he shuang chong ding wei te xing 。jing ruan jian fen xi ORF4dan bai xu lie zhong cun zai liang ge α-luo xuan jie gou yu ,dan bu cun zai kua mo jie gou 。gen ju yu ce suo de de α-luo xuan jie gou fen bu jie guo ,gou jian yi ji lie ORF4jie duan ti fen xi chu ORF4an ji duan 1-30aacheng dian zhuang fen bu yu bao jiang ,yu xian li ti you gong ding wei ,gai jie guo di shi ORF4dan bai de an ji duan bao han 24-30aachu α-luo xuan de 1-30aaan ji suan xu lie shi ji ding wei xian li ti de guan jian ou yu 。3.PCV2 0RF4dan bai gong neng fen xi wei le fen xi ORF4dan bai gong neng ,ben yan jiu jiang ORF4shun shi zhuai ran yu 293T、PK15ji 3D4/31san chong xi bao ,jian ce zong ti diao wang zhi biao ,jie guo xian shi :caspase-3jian qie ti han liang xian zhe gao yu yin xing dui zhao 。ran er ,zai ORF4guo biao da xi bao ji zhong ,mo lun shi fou jia ru MG132yao wu ,caspase3qie ge liang dou mei you ming xian gai bian 。dui shun shi biao da ORF4ji huo de diao wang tong lu yan jiu jie guo xian shi ,zai guo biao da ORF4xi bao zhong ,caspase9jian qie ti han liang xian zhe zeng duo ,bao jiang zhong xi bao se su chan liang xian zhe sheng gao ,dan diao wang you dao yin zi AIFshi fang xian xiang bu ming xian 。shang shu shi yan jie guo di shi shun shi biao da ORF4ke you dao caspaseyi lai de xian li ti diao wang 。hou xu zhen dui shun shi he wen ding zhuai ran ORF4dui diao wang ji huo de bu tong ,jie shi ORF4dui diao wang de ji huo yu ji xian li ti ding wei te xing xiang guan 。sui hou ,wo men tan suo gan ran qing kuang xia ORF4zai diao wang zhong suo fa hui de gong neng 。li yong ben shi yan shi bao cun wPCV2ji ORF4que shi tu bian ti bing du (m4PCV2)fen bie gan ran PK15xi bao ,72hhou jian ce ge xiang diao wang zhi biao 。jie guo xian shi ,ORF4que shi du gan ran xi bao zhong ,caspase3ji caspase9jian qie ti han liang 、DNApian duan hua shu mu yi ji xi bao se su c(cytc)shi fang liang jun xian zhe jiang di ,di shi PCV2gan ran hou ke tong guo ORF4dan bai biao da ji huo xi bao nei xian li ti diao wang tong lu 。zeng shang suo shu ,xian li ti ding wei de ORF4dan bai ke ji huo caspaseyi lai de xian li ti diao wang 。4.PCV2 ORF4dan bai you dao diao wang ji zhi yan jiu wei le fen xi ORF4you dao xian li ti diao wang ji zhi ,tong guo dui ORF4yu xian li ti tong tou xing zhuai huan kong jing fu ge wu dan bai xian piao ling he gan suan zhuai yi mei IIIya xing (ANT3)ji ya li yi lai xing fu li zi tong dao I(VDAC1),xi bao se su cyang hua mei VIIIAya ji jin hang mian yi gong chen dian shi yan ,jie guo xian shi ORF4zhi yu ANT3fa sheng te yi xing jie ge ;3D-SIMfen xi hou jin yi bu que ding le ORF4yu ANT3de xiang hu jie ge 。Co-IPji GST-Pull downshi yan xun zhao yu ANT3hu zuo de ORF4ju ti ou yu ,jie guo xian shi ORF4de 1-30aabu jin shi ORF4de xian li ti ding wei xu lie ,tong yang ye shi yu ANT3jie ge de guan jian jie gou yu 。tong guo RNAide fang fa dui xi bao nei yuan xing ANT3dan bai biao da jin hang gan rao ,fa xian zai ANT3qiao jiang de xi bao ji zhong ,bu jin ORF4guo biao da dao zhi de lie jie de caspase3han liang jian ruo ;tong yang PCV2you dao de caspase3、9lie jie cheng du yi ji shi fang dao bao jiang zhong de xi bao se su cde han liang ye you yu ANT3de qiao jiang er xian zhe jiang di 。shang shu shu ju biao ming ANT3zai ORF4guo biao da ji PCV2gan ran you dao de xian li ti diao wang zhong fa hui zhao guan jian zuo yong 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自浙江大学的林翠，发表于刊物浙江大学2019-09-16论文，是一篇关于猪圆环病毒型论文,蛋白论文,线粒体凋亡论文,腺嘌呤核苷酸转移酶亚型论文,浙江大学2019-09-16论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自浙江大学2019-09-16论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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