论文摘要
水稻是重要的粮食作物，也是单子叶植物研究的模式植物。随着水稻基因组计划的完成，解析基因功能，进而根据其功能在作物遗传改良中加以利用日益成为后基因组学的重要研究内容。高盐、干旱和低温等环境胁迫是影响植物生长和作物高产的重要限制因素。本研究选择与逆境胁迫相关的TFIIIA型锌指蛋白基因进行研究，以期获得在作物抗逆性改良方面具有应用潜力的候选基因。本研究取得了以下研究进展：利用生物信息学手段和RT-PCR方法从水稻幼苗组织中分离了两个新的TFIIIA型锌指蛋白基因RZF5和RZF71，其编码产物都含有两个典型的C2H2型锌指结构。RZF5编码171个氨基酸残基，分子量为17.95 kDa；RZF71编码产物为250个氨基酸残基，分子量为25 kDa。组织表达分析表明，RZF5和RZF71在水稻根、茎、叶和幼穗组织中均有不同程度的表达，RZF5在各组织中的表达丰度相差不大，而RZF71在根中表达丰度相对较高。诱导表达分析表明，在150 mmol·L-1 NaCl和20％PEG6000胁迫的水稻幼苗中，RZF5和RZF71的表达都显著增强，低温（4℃）和0.1 mmol·L-1 ABA处理对两个基因的表达量影响不大。基因的电子定位结果显示RZF5位于水稻第1染色体长臂，RZF71位于第12染色体长臂。对RZF5和RZF71基因起始密码子上游1，500bp的基因组序列进行分析表明，它们的启动子区舍有多个逆境胁迫相关元件，其中RZF5的启动子区含有1个脱落酸应答元件ABRE（ABA response element）、2个干旱应答元件CRT／DREs（C-repeat／dehydration-response element）、5个MYB识别位点MRSs（sequence homologous to MYB recognition site）和1个W-box；在RZF71的启动子区含有1个干旱应答元件DRE、3个MYB识别位点序列MRSs、1个CBF表达诱导子ICE（inducer of CBF expression）识别元件和1个W-box。将RZF5基因启动子区与GUS报告基因融合后转化水稻愈伤组织，GUS报告基因的表达受到150 mmol·L-1NaCl和20％PEG6000的诱导，受低温（4℃）诱导不明显。将RZF5和RZF71基因编码区与GFP融合后构建融合表达载体，通过农杆菌介导法分别转化洋葱表皮细胞和水稻愈伤组织细胞，结果表明，融合蛋白仅在细胞核中表达。构建了RZF5基因过量表达的表达载体，通过叶盘法将RZF5转化烟草，获得18株过量表达RZF5的转基因烟草植株，其中16株（T0代）明显矮化，为对照株高（105cm）的40.9％-57.1％。对T1代转基因烟草幼苗进行抗逆性分析表明：100 mmol·L-1和200 mmol·L-1NaCl处理15d后，植株的根长为未处理植株的36.1％和17.4％，与非转基因植株（15.3％、1.4％）相比差异极显著；在300 mmol·L-1和500 mmol·L-1甘露醇处理下，转基因植株的根长为未处理植株的98.0％和67.6％，与非转基因植株（62.2％、24.3％）相比差异极显著；在4℃条件下，转基因植株与非转基因植株的生长都受到明显抑制，其与正常温度下生长的植株相比相对鲜重分别为22.2％和22.4％无明显差异。通过农杆菌介导法将RZF5和RZF71两个基因分别转化水稻，获得过量表达、抑制表达和发夹结构引起RNA干涉的转基因植株，25株过量表达RZF5的转基因水稻中，16株植林（T0代）的平均株高为54.5cm，为非转基因植株株高的49.5％-61.6％。过量表达RZF71的转基因植株（T0代）农艺性状没有明显变化。对转基因水稻的耐逆性分析表明，3个过量表达RZF5转基因水稻（T1代）株系在冷胁迫36h后，电解质渗透率分别为8.54％、11.20％和1.70％与对照（84.18％）相比差异达到极显著水平；在含150mmol·L-1NaCl的培养基上三个株系出苗率分别为79.5％、82.5％和92.5％，与对照（62.5％）相比差异极显著；4-5叶期的T1代转基因幼苗用150 mmol·L-1的NaCl处理7d后，其相对株高、相对干重和相对鲜重都明显高于对照。花药培养作为一种组织培养技术，不仅已成为研究生理、生化和遗传常用的重要方法，而且对于生理学及分子生物学中基因调控、表达机理的阐明有重要意义；花药培养建立的双单倍体群体，是AFLP、RAPD、SSR等分子标记选择育种和基因图谱构建的理想材料。提高花药培养效率，一直是科技工作者进行研究的主题。本研究以黑壳子粳／苏御糯、铁杆青／苏御糯和薄稻／苏御糯3个籼粳杂交F1及其亲本和粳稻品种武运粳8号为试验材料，在M8基本培养基中，加入不同浓度的植物激素类物质和有机营养物，建立籼粳杂交F1高效花药培养技术体系。结果表明：M8+2mg·L-12，4-D+1mg·L-1 NAA+0.2 mg·L-1KT为最佳诱导培养基，籼粳杂交F1花药愈伤组织诱导率达4.1％-4.5％；在该培养基中添加水解酪蛋白或酵母提取物，能明显提高诱导率，增幅达20.5％-27.3％；M8+2.5mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1KT为最佳分化培养基，籼粳杂交F1愈伤组织的绿苗分化率达14.3％-25.0％。