论文摘要
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,简称SOD）在生物体内起着非常重要的作用,它是一类广泛存在于生物体的各个组织中的金属酶。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种甲基营养型酵母。本文构建表达人Cu,Zn-SOD的重组酵母工程菌株,在摇瓶水平探索不同外界条件对培养上清酶活性的影响,测试目的蛋白酶的稳定性根据酵母密码子偏好性,化学合成人Cu,Zn-SOD基因,克隆至真核表达载体pPIC9K中,将pPIC9K-SOD线性化后电转化毕赤酵母GS115。经PCR鉴定阳性转化子,用G418筛选高拷贝转化子,并用甲醇诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE（12%）和Western blot检测。用Lowry法测定蛋白含量,用改进的邻苯三酚法测定目的蛋白酶活性,测定不同外界条件下培养液上清中的酶活性,测试粗酶液对化学试剂,温度和pH的稳定性。SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达目的蛋白质的相对分子量为18KD左右,低糖基化,目的蛋白占外分泌蛋白总量的27%,Lowry法测定目的蛋白最高表达量为91mg/L。活性测定实验结果表明,最佳条件下培养液上清的酶活性为334U/ml,粗酶对氯仿和乙醇稳定,对H2O2不稳定,粗酶对温度和pH都较稳定。最佳发酵条件初步确定为初始pH6.0,维持甲醇浓度1.5%,持续培养96小时。在毕赤酵母GS115细胞内成功表达了具备酶活性的人Cu,Zn-SOD。初步确定了发酵的的最佳条件和粗酶液对化学试剂,温度和pH的稳定性。
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