负载抗肿瘤药物的高分子纳米材料体内外抗肿瘤效果的研究

论文摘要

上世纪九十年代以来,纳米技术的兴起结合各种生物相容或生物降解型高分子的大量涌现,使得基于高分子纳米微粒的药物输送体系受到了人们广泛的关注。众多研究显示,高分子纳米微粒药物载体除了具备传统药物输送体系所具有的诸如提高药物溶解度、增加药物稳定性以及缓释等优点外,还可以大幅度地改变药物的组织分布和代谢,提高药效并降低副作用,对临床应用具有重大的应用价值。此外,由于肿瘤等病变部位的血管丰富,内皮细胞缝隙远大于正常组织中微血管内皮细胞间隙,再加上肿瘤组织中淋巴回流缺失,造成大分子类物质具有选择性高通透性和滞留性（EPR效应）,因此当高分子纳米微粒循环至肿瘤所在部位的时候其能够通过这种被动靶向作用进入肿瘤等病变部位。而相比于自由药物,高分子纳米微粒还能够有效地延长药物在体内的循环时间,更好地发挥载药纳米微粒的EPR效应,使得药物能够最大限度地发挥在病灶靶部位的疗效。尽管高分子纳米微粒作为药物输送体系有着它独特的优点,但是由于肿瘤组织的一些结构特点,使得无论是药物,还是载药纳米微粒都存在在肿瘤组织中的扩散困难和穿透性差。首先许多肿瘤细胞不在血管周围,甚至远离血管；此外肿瘤的供血血管往往迂曲变形,同时由于缺乏淋巴系统,使得肿瘤组织的组织间压力升高。基于以上原因,药物或载药纳米微粒实际上不可能从血管顺利弥散到所有肿瘤细胞并在细胞内达到足够的浓度,而肿瘤组织细胞外基质的成分异常,也会阻碍药物或载药纳米微粒在肿瘤组织内的扩散。这样,药物就不能被运送到所有的肿瘤细胞中,这大大降低了其抗肿瘤效果。因此,载药高分子纳米微粒在肿瘤组织中的扩散对其抗肿瘤效果是非常关键的。然而,遗憾的是,目前在这一领域的研究中,只有极少一部分工作涉及到了大分子载体在肿瘤组织中的扩散行为。此外,对于载药纳米微球的瘤内注射给药方式,这种局部化疗方式不仅有效的提高了肿瘤内的药物浓度,并且延长了药物在肿瘤内的存留时间,从而提高了药物的抗肿瘤效果,大幅度的降低了药物的系统毒副作用。然而,在对于卵巢、胃、肠癌这类具有腹膜内癌扩散特征的恶性肿瘤的临床治疗中,由于肿瘤在腹腔内的转移和浸润作用,使得它们具有尺寸小,分布广和数量多的特点。此外,一些肿瘤入侵的区域只能在微观尺度下才能观察到,肉眼难以观察。这就给临床上的手术切除治疗和局部化疗带来了极大的困难。因此,肿瘤内注射给药就成为无的放矢,不能有效地抑制所有的肿瘤细胞和防止肿瘤细胞的浸润和转移。另外,与静脉注射给药方式类似,通过瘤内注射的载药纳米微球也只能影响瘤内注射点周围的肿瘤细胞,而不能有效地穿透肿瘤组织的细胞外基质而作用于所有的肿瘤细胞。为了充分发挥抗肿瘤药物高分子纳米载体输送体系的优势,并针对以上列举的该领域研究中存在的部分问题,本论文开展了以下五个方面的研究工作：（1）我们选用带正电的生物相容性的聚电解质天然大分子明胶（GEL）与带负电的单体丙烯酸（AA）形成高分子—单体对反应体系,通过引发AA聚合,制备了分散性良好的明胶—聚丙烯酸（GEL-PAA）纳米微球。通过调节引发剂用量或者反应物的浓度实现了对GEL-PAA纳米微球粒径的控制。用25%戊二醛水溶液作为交联剂交联纳米微球中的GEL部分显著地提高了GEL-PAA纳米微球对高pH环境以及高盐浓度的耐受能力。（2）我们利用GEL-PAA纳米微球中的羧基与抗肿瘤药物顺铂形成的比较强的化学配位作用将顺铂包覆在纳米微球中,得到了非常令人满意的包封率与载药量。载药后的纳米微球显示了良好的体外缓释特性和较高的动力学稳定性。接着,我们考察了纳米微球的体外细胞毒性实验,我们发现空白纳米微球没有显示细胞毒性,而载药纳米微球则展示了与同浓度裸药相当的细胞毒性。此外,我们通过近红外荧光造影考察了载药纳米微球的体内分布及肿瘤靶向能力,然后我们又通过放射性核素标记的载药纳米微球定量地考察了纳米微球在荷瘤小鼠血液以及各组织中的分布。结果表明,我们的载药纳米微球不仅可以大量的累积到肿瘤部位,而且那些没有靶向到肿瘤组织的纳米微球还可以轻易地通过肝胆代谢的途径和肾代谢的途径被排谢出体外,有效地降低了药物的毒副作用。接下来,我们又通过系统给药的方式考察了顺铂纳米微球的体内抗肿瘤效果,结果表明在相同的给药剂量下,载药纳米微球组展示了比顺铂裸药组更加出众的体内抗肿瘤效果,并且顺铂纳米微球的治疗方式大大地提高了荷瘤小鼠的生存时间。（3）我们选用明胶水凝胶（果冻）作为负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的载体,然后将负载载药纳米微球的果冻植入体内并贴敷在肿瘤部位,考察了其体内抗肿瘤效果以及药物的体内生物分布,并且与临床中最常用的传统的静脉注射给药方式进行了比较。我们发现将载球果冻贴敷在肿瘤组织上的治疗方式改变了顺铂的体内生物分布,不仅显著地提高了药物在肿瘤组织中的浓度,延长了药物在肿瘤组织中的驻留时间,而且还降低了药物在正常组织中的累积,有效地减小了药物的体内毒副作用。因此,相比于载药纳米微球的静脉注射给药,载药纳米微球的瘤周给药方式得到了更加出众的体内抗肿瘤效果,并且有效地延长了荷瘤小鼠的生存时间。（4）我们对于在静脉注射和果冻局部贴敷两种给药方式下,载药纳米微球在肿瘤组织中的扩散与分布进行了深入的探讨。对于静脉注射的给药方式,我们发现在给药后4h,载药纳米微球已经从肿瘤血管中溢出并主要分布在了肿瘤血管的边缘。而到了24 h,载药纳米微球已经开始远离了肿瘤血管,分布在血管周围20μm的区域内,证明了载药纳米微球在肿瘤组织中的扩散。对于果冻局部贴敷的给药方式,我们证明了载药纳米微球不但可以从果冻中扩散进入到肿瘤组织的外层区域,而且一些载药纳米微球还能够从肿瘤外层的血管进入血流,并且顺着血流再从肿瘤组织内部的血管溢出和渗透,而这些位置单纯的通过纳米微球从肿瘤外层扩散是达不到的。（5）我们通过对制备出的直径为35nm的GEL-PAA纳米微球进行冷藏,得到了结构规整的GEL-PAA纳米棒,通过考察,我们证实了纳米棒是由GEL-PAA纳米微球一维自组装而形成的。我们发现,纳米棒的形成受到了储存温度以及其内部PAA分子量的影响。通过CD光谱的数据,我们认为纳米棒的形成是由于纳米微球表面的明胶分子具有在低温下复性成为类似胶原的三螺旋结构的能力。此外,我们还以甲基橙为模板,制备出了明胶纳米管。并且将抗肿瘤药物顺铂负载到了明胶纳米管上,考察了其细胞毒性,为今后的体内抗肿瘤疗效研究打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1. 前言
• 2. 高分子纳米药物载体的制备
• 2.1. 小分子单体聚合制备的高分子纳米微粒
• 2.2. 两亲性嵌段共聚物自组装成纳米微粒
• 2.3. 树枝状聚合物纳米微粒
• 2.4. 天然高分子纳米微粒
• 2.5. 高分子聚电解质复合纳米微粒
• 3. 高分子纳米药物载体的表征与评价方法
• 3.1. 高分子纳米药物载体形态的表征
• 3.2. 高分子纳米药物载体粒径和表面电荷的表征
• 3.3. 载药高分子纳米微粒的包封率与载药量
• 3.4. 载药高分子纳米微粒的体外释放实验
• 3.5. 载药高分子纳米微粒的体外动力学稳定性
• 3.6. 载药高分子纳米微粒的有效性和安全性评价
• 4. 高分子纳米药物载体的靶向性
• 4.1. 被动靶向
• 4.2. 主动靶向
• 5. 高分子纳米药物载体的给药方式
• 5.1. 静脉注射给药
• 5.2. 局部给药
• 6. 高分子纳米药物载体在肿瘤组织中的渗透与扩散
• 7. 高分子纳米药物输送体系研究中存在的问题
• 8. 本论文的主要内容及创新性
• 参考文献
• 第二章 明胶-聚丙烯酸复合纳米微球的制备与表征
• 1. 前言
• 2. 实验部分
• 2.1. 材料
• 2.2. GEL-PAA纳米微球的制备
• 2.3. 理化性质表征
• 2.4 形貌观察
• 2.5 纳米微球的交联与稳定性
• 3. 结果与讨论
• 3.1. GEL-PAA纳米微球的制备
• 3.2. 粒径的控制
• 3.3. GEL-PAA纳米微球的形成机理
• 3.4. GEL-PAA纳米微球的交联
• 4. 结论
• 参考文献
• 第三章 负载顺铂的明胶-聚丙烯酸纳米微球的体内外抗肿瘤效果评价
• 1. 前言
• 2. 实验部分
• 2.1. 材料
• 2.2. 细胞系和动物
• 2.3. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的合成
• 2.4. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的表征
• 2.5. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的体外释放
• 2.6. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的动力学稳定性测试
• 2.7. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的细胞毒性实验
• 2.8. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的细胞摄取实验
• 2.9. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球在荷瘤小鼠中的分布
• 2.10. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的体内抗肿瘤效果
• 2.11. 肿瘤组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色
• 2.12. 肿瘤组织切片中凋亡细胞和增殖细胞的测定
• 2.13. 正电子发射计算机断层/电子计算机X射线断层扫描（PET/CT扫描）
• 2.14. 统计学处理
• 3. 结果与讨论
• 3.1. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的制备与表征
• 3.2. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的体外释放
• 3.3. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的动力学稳定性
• 3.4. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的体外细胞毒性
• 3.5. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球在荷瘤小鼠中的分布
• 3.6. 负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的体内抗肿瘤效果
• 4. 结论
• 参考文献
• 第四章 包裹负载顺铂的明胶-聚丙烯酸纳米微球的明胶水凝胶的体内抗肿瘤效果以及体内分布研究
• 1. 前言
• 2. 实验部分
• 2.1. 材料
• 2.2. 细胞系和动物
• 2.3. 包裹负载顺铂的GEL-PAA纳米微球的果冻的制备
• 2.4. 体内抗肿瘤效果
• 2.5. 体内分布实验
• 2.6. 苏木精-伊红（H&E）染色
• 2.7. 统计学处理
• 3. 结果
• 3.1. 载球果冻贴敷在小鼠肿瘤部位
• 3.2. 载球果冻的体内抗肿瘤效果
• 3.3. 药物的体内生物分布
• 3.4. 体内毒性评价
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 参考文献
• 第五章 明胶-聚丙烯酸纳米微球在肿瘤组织中的渗透与扩散
• 1. 前言
• 2. 实验部分
• 2.1. 材料
• 2.2. 细胞系和动物
• 2.3. 肿瘤组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色
• 2.4. 生物素标记的载药纳米微球在肿瘤组织中的扩散
• 2.5. 免疫荧光实验
• 2.6. 负载顺铂的GEL-PAA-Au复合纳米微球的制备与表征
• 2.7. 果冻局部贴敷的给药方式下载药纳米微球在肿瘤中的分布
• 3. 结果与讨论
• 3.1. 静脉注射的载药纳米微球在肿瘤组织中的扩散
• 3.2. 通过果冻局部贴敷给药的载药纳米微球在肿瘤组织中的扩散
• 4. 结论
• 参考文献
• 第六章 明胶-聚丙烯酸纳米棒与明胶纳米管的制备
• 1. 前言
• 2. 实验部分
• 2.1. 材料
• 2.2. GEL-PAA纳米棒的制备
• 2.3. 明胶纳米管的制备
• 2.4. 负载顺铂的明胶纳米管的制备
• 2.5. 理化性质表征
• 2.6. 形貌观察
• 2.7. 圆二色光谱分析
• 2.8. 负载顺铂的明胶纳米管的载药量的测定
• 2.9. 负载顺铂的明胶纳米管的细胞毒性实验
• 3. 结果与讨论
• 3.1. GEL-PAA纳米棒的合成与表征
• 3.2. 形成GEL-PAA纳米棒的影响因素
• 3.3. GEL-PAA纳米棒的形成机理
• 3.4. 明胶纳米管的合成与表征
• 3.5. 明胶纳米管作为顺铂的载体
• 4. 结论
• 参考文献
• 第七章 今后的工作及展望
• 已发表和待发表论文
• 致谢