农杆菌介导小麦锌转运蛋白基因转化烟草及其抗逆性研究

论文摘要

锌是一种重要的生命元素，生命过程中的每个重要阶段都可发现锌的作用。研究发现，细胞锌转运途径主要由锌铁调控转运体ZIP和助阳离子扩散体CDF两大锌转运体家族来完成。植物体中锌的吸收、胞外到胞内的转运以及细胞内锌的转移，ZIP转运体起着重要的作用。有研究报道已经在拟南芥、小麦、西红柿、大豆、水稻等多种植物中鉴定出ZIP转运体家族成员。其中对小麦中锌转运相关基因的研究主要集中在基因克隆和表达特性上，但它们的转基因研究还未见报道。所以，本试验将已克隆到的一个小麦锌转运蛋白（以下简称ZIP）基因转化到烟草中，研究小麦ZIP基因在烟草中的作用，为全面的理解小麦ZIP基因在转基因应用中的功能、培育多抗性的作物品种提供科学依据。本文根据GenBank上已提交的序列（AY864924）设计引物，克隆到小麦ZIP基因片段长度为1083bp，并构建了烟草表达质粒载体，将其转入农杆菌C58C1中。以烟草叶片为外植体，通过农杆菌的介导将小麦ZIP基因导入烟草中，经过组织培养，获得了转基因植株。通过对转基因植株进行RT-PCR检测和GUS组织化学染色检测，证明小麦锌转运蛋白基因已导入烟草中。通过对烟草的干旱胁迫、高盐胁迫和铜胁迫试验，测定胁迫后的相对含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、保护酶类活力和丙二醛含量6种生理生化指标。结果表明，转基因组烟草对干旱的耐受程度和对高盐环境的抵御能力较强于对照组烟草，铜对转基因烟草产生的毒害较对照组烟草低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 ZIP 锌转运体
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 ZIP 研究进展
• 1.2 转基因烟草
• 1.3 农杆菌叶盘转化法
• 1.3.1 农杆菌转化系统
• 1.3.2 农杆菌叶盘转化法
• 1.4 转基因植物的检测
• 1.4.1 报告基因的表达检测——gus 基因的检测
• 1.4.2 外源基因的 PCR 检测——RT-PCR 检测
• 1.4.3 外源基因表达蛋白的检测——Western Blot
• 1.5 植物抗逆境研究
• 1.5.1 干旱胁迫对植物的影响
• 1.5.2 盐胁迫对植物的影响
• 1.5.3 重金属胁迫对植物的影响
• 1.6 研究目的及意义
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与材料
• 2.1.2 工具酶和试剂盒
• 2.1.3 主要溶液
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦锌转运蛋白转基因烟草 T0代的获得与鉴定
• 2.2.2 小麦锌转运蛋白转基因烟草 T1代抗逆性初步研究
• 第三章 结果与分析
• 3.1 小麦锌转运蛋白转基因烟草 T0代的获得与鉴定
• 3.1.1 小麦锌转运蛋白基因克隆
• 3.1.2 烟草转化载体构建
• 3.1.3 Mtn-pBI121 重组质粒转化农杆菌检测
• 3.1.4 转基因烟草 T0代获得
• 3.1.5 转基因烟草 T0代检测
• 3.2 小麦锌转运蛋白转基因烟草 T1代抗逆性初步研究
• 3.2.1 干旱胁迫
• 3.2.2 高盐胁迫
• 3.2.3 铜胁迫
• 第四章 讨论
• 4.1 小麦锌转运蛋白基因转化受体选择
• 4.2 农杆菌侵染外植体时间和共培养时间
• 4.2.1 农杆菌侵染外植体时间
• 4.2.2 农杆菌与外植体共培养时间
• 4.3 转基因过程中的污染问题
• 4.4 烟草转化过程中的问题
• 4.4.1 植株玻璃化现象
• 4.4.2 植株白化苗现象
• 4.4.3 转基因植株移栽
• 4.5 RT-PCR 鉴定
• 4.6 Western Blot 鉴定
• 4.7 转基因烟草 T1代干旱胁迫、高盐胁迫、铜胁迫研究
• 4.7.1 转基因烟草 T1代干旱胁迫研究
• 4.7.2 转基因烟草 T1代高盐胁迫研究
• 4.7.3 转基因烟草 T1代铜胁迫研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历