论文摘要
本研究以不同父系来源的卵母细胞为研究对象,探索卵母细胞父系遗传背景对核移植和孤雌胚胎发育潜力的影响。论文主要从以下5方面进行研究。1.供核细胞的准备本研究用ICR小鼠荧光标记的胎儿皮肤细胞为供核细胞,比较消化法和组织块法对分离细胞效率的影响,采用细胞饥饿培养法处理细胞。结果发现消化法获得细胞的效率显著高于组织块法（3 d vs 7 d）。2.卵母细胞的准备以3种不同品系的雄鼠（129、C3H、ICR）与昆明（KM）雌鼠杂交后F1代雌鼠为研究对象,KM为对照,研究不同品系雄鼠与远交系的KM雌鼠交配后的产仔数、雌雄比率和F1代雌鼠的超数排效果。发现杂交后试验组与对照组之间的平均产仔数和F1代雌鼠（试验组:129×KM F1,C3H×KM F1,ICR×KM F1;对照组KM）的雌雄比率差异不显著,分别为9±1.60（n=21）, 9±2.40（n=23）, 8±1.60（n=22） vs 8±1.97（n=25）;P>0.05和49.5%（101/203）, 54.3%（98/198）, 52.5%（115/212） vs 49.4%（94 /179）; P>0.05。F1代雌鼠性成熟期的雌鼠超数排卵,试验组与对照组之间获取卵母细胞和可用卵母细胞的数量差异不显著,分别为34.0±4.5（n=19）, 31.9±8.4（n=18）,34.9±7.5（n=17） vs 36.7±9.1（n=16）;P>0.05和27.9±10.4（n=19）,26.7±7.4（n=18）,28.9±10.7（n=17）vs 29.3±7.5（n=16）;P>0.05。结果显示,这几种不同品系的雄鼠与KM雌鼠交配后不影响KM雌鼠的产仔和F1代小鼠的雌雄比率。这几种不同父系遗传背景的小鼠经超排后不影响其超排数量与质量。3.不同父系卵母细胞对核移植效率的影响①用两种规格的毛细管（100mm×0.1mm和100mm×0.2mm）制作的注核细管对注核效率进行比较,100mm×0.2mm的毛细管制作的注核细管比100mm×0.1mm规格的毛细管能显著地提高注核成功率（86% vs 5%, P<0.05）,并且缩短注核时间（<30s vs >1min）。②以129/Sv、C3 H和ICR雄鼠分别与昆明（KM）雌鼠杂交的F1代雌鼠为研究对象,以KM为对照,比较卵母细胞的可操作性以及重构胚的激活率、卵裂率和囊胚发育率。结果显示:129/Sv×KM、C3H×KM和KM的去核效率显著高于ICR×KM （78.0%、82.9%、81.0% vs 63.9%; P<0.05）;129/Sv×KM的注核成功率显著高于C3H×KM F1、ICR×KM F1和KM（83.0% vs 59.6%、55.5%, 71.4%; P<0.05）;129/Sv×KM F1的重构胚激活率显著高于C3H×KM F1、ICR×KM F1和KM（97.3% vs 85.2%、81.7%、78.3%; P<0.05）;C3H×KM F1的卵裂率和囊胚率显著高于ICR×KM F1和KM（84.5%、28.2% vs63.2%、11.4%,64.5%、16.5%; P<0.05）。③129/Sv×KM F1、C3H×KM F1、KM的重构胚胎和对照组（正常的KM体内受精胚胎）分别进行原核期的输卵管移植和囊胚期的子宫角移植发现,129/Sv×KM F1、C3H×KM F1、KM的克隆胚胎均未妊娠与对照差异显著,分别为0%,0%,0% vs 41.6%, P<0.05和0%,0%,0% vs 60.3%; P<0.05。研究表明,0.1mm规格的毛细管制作的注核细管可显著提高注核效率;129/Sv、C3H和ICR 3个品系父系遗传背景影响小鼠体细胞核移植效率,其中129/Sv和C3H父系遗传背景的卵母细胞可提高体细胞核移植效率;129/Sv×KM F1、C3H×KM F1、KM的重构胚胎移植给假孕小鼠后没有妊娠产仔。4.不同父系卵母细胞对孤雌胚胎体外发育的影响以两种近交系雄鼠（129/Sv、C3H）与昆明系（KM）雌鼠的杂交一代（F1）雌鼠为研究对象,KM为对照,激活方法分别是离子霉素（Ion）+6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）和鍶离子（Sr2+）+细胞松弛素B（CB）,比较不同激活方法对试验组和对照组的激活效果,以及试验组与对照组孤雌胚胎的发育能力。结果显示,两种杂交小鼠F1代与对照组孤雌胚胎的卵裂率和激活率没有显著差异（P>0.05）;Ion+6-DMAP激活组的1原核比率和2-细胞期碎裂率显著高于Sr2++CB激活组（p<0.05）。两组均表现为Sr2++CB激活组的囊胚率显著高于Ion+6-DMAP （p<0.05）;同时,两种激活方法均表现为试验组显著高于对照组（p<0.05）。5.不同父系卵母细胞对分离ntES和pES效率的影响分别对试验组（129/Sv×KM F1, C3H×KM F1）和对照组（KM）卵母细胞的重构胚胎和孤雌胚胎分离ntES和pES,结果显示重构胚胎接种饲养层后,试验组的贴壁率显著高于对照组（13.0%,10.0% vs 0%; P<0.05）。但是试验组没有形成明显的ICM,没有分离到ntES细胞。孤雌胚胎接种后,试验组与对照组的贴壁率没有显著差异（67.8%, 66.7% vs 55.0%, P>0.05）。对照组的ICM分离了5个细胞株,其中一株孤雌胚胎干细胞传到第4代后,集落变黑,再传代时没有贴壁。试验组C3H×KM分离了6个细胞株,只有一株传至7代时发生污染,其他几株细胞也在传代早期污染,未能继续传代。129/Sv×KM分离了6个细胞株,其中一株传至50代,其余在传代早期污染。结果表明,129/Sv和C3H父系背景卵母细胞的重构胚胎很难分离到ntES,而卵母细胞的孤雌胚胎确分离到pES。