论文摘要
精神分裂症（Schizophrenia, MIM 181500）是最严重的精神疾病之一,其发病率在世界不同文化、地理区域中均为1%左右。尽管此前对精神分裂症作了大量研究,但到目前为止,其发病的分子机制仍未阐明。已有的研究表明精神分裂症是一种多因素疾病（Multifactorial disorder）,由遗传、营养、环境和其它未知因素共同作用产生。由于目前对精神分裂症的发病机理尚不明确,因此临床上进行的治疗主要是针对症状而不是病因,所以疾病得不到根治,这使得精神分裂症的基础研究成为当务之急。近年来兴起的基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学为精神分裂症的研究起到了巨大的推动作用。对于精神分裂症的临床治疗来说,服用抗精神分裂症药物仍然是最主要的治疗方式。氯丙嗪是所有抗精神分裂症药物的鼻祖,属于第一代抗精神分裂症药物（即典型性抗精神分裂症药物）,其作用在于阻断中枢神经系统的多巴胺通路,对于治疗精神分裂症的阳性症状非常有效,但易引起严重的副反应。20世纪90年代以后,陆续出现了多种以氯氮平为代表的新抗精神分裂症药物,被称之为第二代抗精神分裂症药物（即非典型性抗精神分裂症药物）,其中还包括喹硫平、利培酮和奥氮平等。非典型性抗精神分裂症药物通常作用于多巴胺受体和5-羟色氨受体。越来越多的实验发现精神分裂症病人的脑部出现线粒体和神经突触体的异常,提示线粒体功能失调、神经突触体结构或功能的异常在精神分裂症的发病中可能起着重要的作用。蛋白质组学是一识别蛋白表达改变的强有力工具,并且已经运用到包括精神分裂症在内的多种疾病的研究当中。本课题利用比较蛋白质组学分析经三种抗精神分裂症药物（氯丙嗪、氯氮平、喹硫平）分别处理34天的Sprague-Dawley大鼠与正常对照之间的大脑皮层和海马中的线粒体,大脑皮层中的神经突触体中异常表达的蛋白。在大脑皮层和海马组织中线粒体的比较蛋白质学实验中,经统计学分析,我们得到了26个蛋白点、14个差异表达的蛋白。我们利用Western blotting对部分差异蛋白进行了蛋白表达水平的验证;利用实时荧光定量PCR （quantitative real time PCR, Q-RT-PCR）考量差异表达蛋白对应的基因在mRNA表达水平是否存在差异。经过通路分析（DAVID pathway analysis）,我们发现这14个差异表达蛋白的功能主要富集于线粒体的能量产生过程即氧化磷酸化（OXPHOS）途径。其中有6个属于ETC（Electron transport chain）成员,分别是Ndufa10,Ndufv2,Ndufs3,Atp5b,Atp6v1b2和Atp6v1a1。前三个属于Complex I成员,Complex I是ETC的限速步骤,Complex I的效率下降,对ETC的影响最为严重,最终导致OXPHOS效率降低。药物处理导致的另外三个ETC下调表达的亚基Atp5b,Atp6v1b2和Atp6v1a1属于ATP合成酶复合体,这种下调表达更为直接地影响ATP的合成。线粒体功能失调、无法维持细胞内ATP水平可能会导致缓慢的神经退行性改变被认为和许多神经系统疾病有关。同样地,我们利用比较蛋白质学对三种抗精神分裂症药物处理的大鼠大脑皮层中神经突触体蛋白进行分析。经过统计学分析,我们共得到了17个差异表达的蛋白,并用质谱鉴定出了其中的12个。在Q-RT-PCR和Western blotting的验证没有得到阳性结果后,我们引入了多元统计学的方法――偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA）对双向电泳数据进行建模。通过反复的建模,我们最终选择了单一药物处理组与对照组之间两两建模。三个模型都能非常好的将药物处理组与对照分开,并且模型中各参数也很理想。在PLS-DA模型中,我们发现一元统计所得的具有统计学意义的阳性点都在多元统计中重复出来。为了考察这些重要的蛋白之间是否存在表达的协同效应,我们对这些蛋白点数据检测是否符合正态分布以后,进行了Pearson’s相关分析。我们得到了非常有意义的结果:在三组药物处理组和对照之间,都出现了药物的作用要么打乱了原有的蛋白之间的协同性（CPZ vs. control）,要么建立新的蛋白之间协同性（QTP vs. control）,或者两者情况都有（CLZ vs. control）。这种现象说明,正是药物发挥的作用使得各组能在PLS-DA模型中彼此分开,也证明这些蛋白点是在跟药物处理或是疾病本身相关的蛋白。为了进一步考察这些蛋白在体内起到的作用,我们将这些蛋白用DAVID pathway analysis在线工具进行了分析,发现这些蛋白广泛参细胞内的众多生理过程,可能与突触负责细胞间通讯有关。其中涉及到的通路或者生理过程主要集中在两个方面。一是影响了与能量相关的线粒体ATP生成功能和糖酵解/糖异生,二是影响了与G蛋白（G protein）耦联的信号跨膜传递功能。突触体中含有大量的线粒体为细胞通讯、信号传导供应能量。任何影响线粒体产能系统的不利因素最终都会影响到脑部的发育与正常的功能。抗精神分裂症药物作用后使突触中的能量产生系统受到影响,可能是药物本身的作用,也可能是机体对药物处理的反应以自我保护。G蛋白相关的信号传递途径中,G蛋白耦联的受体在机体中扮演着重要的角色,一旦GPCRs的不能正常行使其功能,机体不能对内外界的刺激或信号做出正确的应答而出现疾患。此外,在线粒体和神经突触体的实验中,我们找到的很多差异表达蛋白在已有的研究中显示参与到了精神分裂症或药物作用当中。我们实验的结果将有助于解释大鼠或人体对抗精神分裂症药物的反应,提高我们对这类药物对线粒体和突触体功能的影响的认识,并有助于我们进一步了解抗精神分裂症药物的作用和副作用。
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