论文摘要
肝癌细胞的多药耐药性（multidrug resistance,MDR）形成是导致肝癌化疗失败的主要原因之一。肝癌细胞一旦获得多药耐药性,则在对同一类型的药物产生抗药性的同时,对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物均产生交叉耐药性。多药耐药性形成直接关系到肝癌患者对化疗的反应和预后。经研究现已发现了导致MDR产生的多个表征蛋白及相关靶点,并据此研究出多种相应的化疗增敏药物及治疗方法,但均因各种原因限制了其应用。MDR产生机制复杂,其中化疗诱导MDR产生的上游信号机制仍需进行大量的探索工作。近年研究发现,在血红素代谢过程中,由血红素加氧酶（heme oxygenase-1,HO-1）催化产生的多种物质均具有细胞保护作用。HO-1在多种实体性肿瘤中均有高表达,因其具有保护细胞凋亡的作用,提示HO-1可能是抑制肿瘤生长的新靶标。本课题以Bel/FU肝癌耐药细胞株为研究对象,应用氯化高铁血红素（Hemin）、锌原卟啉（zinc protoporphyrinⅨ, ZnPPⅨ）、小分子RNA干扰及中药黄芪影响HO-1的表达,通过研究血红素加氧酶在肝癌细胞多药耐药中的影响及相关信号分子机制,为逆转肿瘤多药耐药寻找新的作用靶点。论文一血红素加氧酶对Bel/FU肝癌耐药细胞株多药耐药性的影响目的:评估血红素加氧酶-1（Heme Oxygenase,HO-1）对Bel/FU肝癌耐药细胞株化疗敏感性的影响,探讨血红素加氧酶对肝癌细胞多药耐药性可能的影响机制。方法:①:将Bel/FU细胞接种于96孔培养板,分三组,一组设为空白对照组,另外两组分别加入60uM的Hemin,10uM的ZnPPⅨ进行诱导24小时后,分别加入不同浓度梯度的ADM、MMC、5-FU化疗药物作用24小时,MTT法检测细胞对各化疗药物敏感性;②:分别加入不同浓度梯度的Hemin（15umol/L,30umol/L,60umol/L,120umol/L,240umol/L）及ZnPPⅨ（2umol/L,6umol/L,10umol/L,14umol/L,18umol/L）诱导培养24小时后,RT-PCR检测血红素加氧酶HO-1（heme oxygenase-1,HO-1）,MDR-1（multidrug resistance,MDR-1）,谷胱甘肽-S-转移酶GST-π（Glutathione S-transferase,GST-π）及β-actin核酸水平表达量;Western blot检测P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-GP）,GST-π及β-actin蛋白质水平表达量;③:设空白对照组后,分别加入Hemin（60umol/L,240umol/L）和ZnPPⅨ（10umol/L,18umol/L）诱导,应用流式细胞仪测定细胞内罗丹明123的潴留以评估P-GP的功能。结果:①:Hemin作用于Bel/FU细胞诱导24小时后,各化疗药物（5-FU,ADM及MMC）半数抑制浓度（IC50）与空白对照组比较各P值均<0.01,化疗药物半数抑制浓度均明显增加;ZnPPⅨ干预组表现则相反,细胞活性降低,各化疗药物半数抑制浓度均显著降低;②:Hemin作用于Bel/FU细胞诱导24小时后,与空白组比较,血红素加氧酶HO-l在核酸水平的表达量明显增加（F=71.513,其中2umol/L组P=0.029,余均<0.01）,MDR-1mRNA及GST-πmRNA的表达量、P-GP及GST-π的蛋白表达量也显著增加（各P值均<0.01）,且均呈剂量依赖趋势;ZnPPⅨ干预组表现则相反,各指标均显著降低,但也表现出剂量依赖趋势;③:罗丹明潴留试验结果显示:与空白组比较,Hemin干预组罗丹明荧光曲线明显左移,且浓度增高曲线左移越明显,提示细胞内罗丹明潴留减少;而ZnPPⅨ干预组则表现为曲线右移,出现相反的结果。结论:影响HO-1的表达可改变肝癌耐药细胞株的化疗敏感性,这种变化是通过影响MDR-1、GST-π核酸及蛋白质水平的表达,同时改变了P-糖蛋白药物外排功能实现的;提示HO-1可作为逆转肿瘤多药耐药的潜在作用靶点。论文二RNA干扰HO-I基因对Bel/FU肝癌耐药细胞株阿霉素化疗敏感性的影响目的:应用siRNA干扰技术特异性地将HO-1基因表达下调后,观察Bel/FU肝癌耐药细胞株阿霉素化疗敏感性的变化及影响机制。方法:设计与制备针对HO-1及β-actin的小分子RNA。①:按正常细胞组、空白对照组、干扰组及阳性对照组,将Bel/FU肝癌耐药细胞接种于六孔板,各组分别加入正常培养基、空脂质体转染培养基、含针对HO-1的siRNA脂质体培养基、含针对β-actin的siRNA脂质体培养基,作用48小时后,RT-PCR检测HO-1、β-actin mRNA表达量,Western blot检测P-GP,β-actin蛋白质水平表达量;②:按正常细胞组、空白对照组、干扰组,应用流式细胞仪测定细胞内罗丹明123的潴留并评估P-GP的功能;③:按正常细胞组、空白对照组、干扰组,分别加入不同浓度梯度的阿霉素,MTT法测定体外阿霉素化疗敏感性。结果:①:siRNAs作用48小时后,干扰组HO-1 mRNA表达被干扰未见表达,而正常细胞组、空脂质体转染组（空白对照组）、阳性对照组未见明显影响;β-actin mRNA则在阳性对照组无表达,其余各组无影响;Western blot显示:与正常培养组及各对照组相比,P-糖蛋白表达量下降;②:罗丹明潴留试验结果显示:与正常培养组及空白对照组相比,siRNAs干扰组罗丹明荧光曲线明显右移,提示细胞内罗丹明潴留增加;正常培养组及空白对照组曲线基本重叠,未见明显差异;③: Bel/FU细胞培养48小时后,与正常组相比,RNA干扰组细胞活性降低,阿霉素半数抑制浓度（IC50）显著降低,而空白对照组与正常组相比无明显差异。结论:应用siRNAs抑制HO-1的表达后,多药耐药细胞株Bel/FU细胞对阿霉素的化疗敏感性增强,这种增敏作用是通过下调P-糖蛋白表达,降低P-糖蛋白罗丹明外排功能而实现的。论文三黄芪对Bel/FU肝癌耐药细胞株化疗敏感性的影响目的:评估黄芪注射液对肝癌耐药细胞化疗敏感性的影响,结合黄芪对血红素加氧酶的调节作用探索可能的影响机制。方法:黄芪注射液作用于Bel/FU肝癌化疗耐药细胞株,从三个方面观察作用前后化疗敏感性的变化:应用MTT法检测细胞株对5-Fu,ADM及MMC作用后的存活率;应用免疫细胞化学检测化疗耐药表征蛋白P-糖蛋白表达量的变化;应用流式细胞术罗丹明外排试验检测黄芪注射液对细胞株P-糖蛋白功能的影响。应用RT-PCR方法检测黄芪注射液作用前后血红素加氧酶（HO-1）核酸水平表达量的变化。结果:①:黄芪注射液作用于Bel/FU细胞诱导24小时后,黄芪各浓度组化疗药物半数抑制浓度（IC50）与空白对照组比较各P值均<0.01,化疗药物半数抑制浓度均显著降低;②:应用8ul/mL黄芪注射液作用于Bel/Fu细胞后,免疫细胞化学检测显示黄芪组（vs对照组） P-糖蛋白阳性表达明显减少（Wilcoxon W值为398.500,Z值为-2.363,近似P值为0.018<0.05）;流式细胞仪罗丹明潴留试验结果显示,黄芪组罗丹明荧光曲线明显右移,细胞化疗药物外排功能降低; Bel/FU细胞HO-lmRNA的表达水平按HO-1cDNA/β-actin黄芪组为0.316±0.08,对照组为0.624±0.173,HO-1mRNA的表达显著减少（P<0.01）。结论:黄芪注射液可增强肝癌耐药细胞株Bel/FU的化疗敏感性,下调化疗耐药表征蛋白P-糖蛋白表达,降低P-糖蛋白药物外排功能,实现这种作用的同时伴随有HO-1mRNA表达的减少。
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